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Deutsche Gesellschaft für Zytometrie (DGfZ)



Abstract Text 1997


10th Heidelberg Symposium
Oct.23-25, 1997



The abstracts are printed in the: Proceedings of the DGfZ Heidelberg Meetings, DKFZ, Heidelberg 1997, ISSN 0949 - 5347

=== ORAL PRESENTATIONS ===


=== APOPTOSIS ===


1. APOPTOSIS IN CANCER
Klaus-Michael Debatin
University Children's Hospital, Ulm, Germany
The development of cancer cells may be a consequence of increased cell survival and decreased cell death (apoptosis). Apoptosis may be induced by withdrawal of growth factors and survival factors or alternatively may be induced by signalling through cell surface molecules such as CD95 (APO-1/Fas). CD95 is expressed on many cell types including activated T and B cells. Following multimerization of CD95 by its natural ligand or agonistic antibodies, a death inducing signalling complex is formed that initiates proteolytic cleavage of ICE/Ced-3 proteases, crucial for transmission of the apoptotic signal. The CD95 ligand is produced by activated T cells and constitutively expressed in a variety of tissues. In activated T cells, T cell receptor mediated apoptosis involves an autocrine suicide via CD95 receptor/ligand interaction. Disturbances of the CD95 system are involved in a variety of pathological conditions and human diseases. Thus, mutations of the receptor have been found in patients with a syndrome of lymphoproliferation and autoimmunity. Recently we discovered that cytotoxic drugs previously thought to inhibit cellular proliferation mainly by metabolic function or DNA damage, activate the CD95 system in chemosensitive cells. Upon incubation with cytotoxic drugs such as doxorubicin, CD95 ligand is produced and initiates a death cascade in an autocrine or paracrine manner. Inhibition of CD95 induced apoptosis in chemosensitive tumor cells leads to drug resistance. Conversely, drug resistant cells are resistant to CD95 induced apoptosis. Inhibition of ICE/Ced-3 proteases involved in the CD95 pathway also confers drug resistance to tumor cells. The discovery of cross resistance between CD95 induced apoptosis and cytotoxicity of anticancer drugs opens new perspectives for treatment of tumors and to overcome drug resistance.
2. THE CD95(APO-1/FAS)-MEDIATE:D DEATH-SIGNAL AND DISEASES
Krammer, P.H.
Tumorimmunology Program, German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany
CD95, a member of the tumor necrosis factor (TNP) receptor superfamily induces apoptosis upon receptor oligomerization. The receptor and its ligand are important for apoptosis of pheripheral T cells, for downregulation of an immune response and most likely, at least in part, also for pheripheral T cell tolerance. In Aids, apoptosis mediated by this system might contribute to the depletion of T helper lymphocytes. Likewise, in diseases in which liver cells are destroyed the CD95 system might play a major role.
In a search to identify intracellular signalling molecules coupling to oligomerized CD95 several cytotoxicity-dependent APO-1 associated proteins (CAP) were immunoprecipitated from the apoptosis-sensitive human leukemic T cell line HUT 78 and the lymphoblastoid B cell line SKW6.4. CAP1-3 and CAP4 instantly detectable after crosslinking of CD95 were only associated with aggregated and not with monomeric CD95. CAP1 and CAP2 were idendified as phosphorylated (MORT1/FADD). CAP4 was a new molecule, designated FLICE (for FADD like ICE), and showed homology to the death effector domain of FADD and to ICE-like proteases. Thus, FLICE was identified as the most CD95 receptor proximal protease which starts the cascade of protease reactions important for CD95-mediated apoptosis. Association of CAP1-4 with CD95 was not observed with C-terminally truncated non-signalling CD95. CAP1 and 2 did also not associate with an CD95 cytoplasmic tail carrying the lpr-cg amino acid replacement. Moreover, no CD95/CAP association was found in the CD95+, anti-CD95 resistant pre B cell line Boe. CAP1-4 form a death-inducing signalling complex (DISC) e CD95 receptor and are, thus, the first CD95 associating proteins of a signalling cascade mediating apoptosis.The function of the DISC is discussed in detail, particularly with respect to its role in sensitivity and resistance to apoptosis.
3. CELL CYCLE REGULATION FOLLOWING INFECTION WITH SIMIAN VIRUS 40
John M. Lehman, Brian Whalen, Thomas D. Friedrich, and Judith A. Laffin
Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, Albany Medical College, Albany NY 12208
Cells lytically infected with viruses, such as SV40, polyoma, HIV-1, CMV, and BPV show changes in cell cycle regulation and provide an opportunity to define the interaction of viral proteins with cellular regulatory proteins. SV40 stimulates both permissive (lytic) and non-permissive cells into successive S phases resulting in tetraploid (>G2) cells. Utilizing flow cytometry, immunoprecipitation, and immunoblotting, our laboratory has defined several altered cell cycle events during SV40 infection of permissive CV-1 cells. Confluent cells, infected with a high multiplicity of virus, were monitored for cell cycle regulatory proteins as they progress through the cell cycle. Cells infected in G1 are stimulated into the cell cycle and by 18 hours pRb is phosphorylated. During the first G1 and S, the time of appearance and quantity of cyclins D, E, A and B proteins are comparable to uninfected cycling CV-1 cells. After reaching a G2 DNA content, the infected cells fail to enter mitosis and progress into a second S phase where there is a reappearance of hypophosphorylated pRB. Cyclin B\cdc2 complexes (MPF) are present but remain in the tyrosine-phosphorylated inactive form. Protein levels of cyclin D and E are decreased, while cyclins A, cyclin B, cdc2 and cdk2 levels are elevated. Cdc25C, a regulator of MPF, is complexed with large T antigen and is also in the inactive form. Cyclin A, which is reported to be required for S phase, is associated with a two-fold higher kinase activity in the second S phase. Complexes between cyclin A and T antigen are also detected. In normal cells cyclin A is reported to form a complex with p21 and PCNA. In SV40 infected cells p21 is present in G1 but disappears by the second S phase, possibly due to T antigen's inactivation of p53. PCNA protein, as measured by immunoblotting, is unchanged throughout the infection. These experiments demonstrate that SV40 disrupts several cell cycle checkpoints and that the regulation of cyclin A and cdc25C by T antigen may aid in identifying these events.
The viral proteins large T antigen and small t antigen are responsible for the progress through the cell cycle. Small t antigen is a 174 amino acid protein, which plays an accessory role in viral replication, and enhances the transformation potential. The most important function is the ability to bind to and inhibit protein phosphatase 2A (PP2A). This in turn prevents the dephosphorylation of several different substrates, including large T antigen and p53, as well as the mitogen-activated protein (MAP) kinase family members ERK2 and MEK1. Flow cytometry results indicated that the dl888-infected cells, in the absence of small t, moved through S phase at the same rate as wild-type infected cells. As the cells began to progress through G2 (>12 hours after release), however, a delay was evident which became noticeable at 24 hours after release from the mimosine blockade. Results from Western analysis suggested the levels of cyclin D (part of the cyclin D-cdk4 complex that begins phosphorylating Rb in G1 phase) are initially high, decrease briefly, and then increase as the delay became more noticeable. This is in contrast to the wild-type infection, in which cyclin D levels remained low throughout the timecourse. There were no significant differences in the expression of other cell cycle proteins, such as cyclins A and B, p21, and cdk4. With respect to Rb, the phosphorylation pattern of the protein was identical to wild-type infected cells until the delay into >G2 entry became apparent. During this time interval the Rb in the dl888-infected cells existed primarily in the hypophosphorylated form. These results suggest that the absence of small t in SV40 infection causes a delay in the movement of infected cells into tetraploidy, and this delay is accompanied by changes in both Rb phosphorylation and cyclin D expression.
4. CYTOMETRY IN CELL NECROBIOLOGY: DETECTION OF APOPTOSIS AND NECROSIS
Zbigniew Darzynkiewicz
The Cancer Research Institute, New York Medical College, Valhalla, N. Y. 10595, USA
Two distinct modes of cell death, apoptosis (Ap) or necrosis (N), can be recognized based on differences in morphological, biochemical and molecular changes of the dying cell (reviews: 1, 2). The wide interest in Ap in oncology, so apparent recently, stems from the observations that this mode of cell death is induced by chemotherapy, radiation or hyperthermia and that the intrinsic propensity of tumor cells to respond by Ap correlates with expression of several oncogenes such as c-myc, ras or bcl-2, or with tumor suppressor gene p53. Furthermore, because during Ap the cell actively participates in its demise, by developing Ap effectors and mobilizing a cascade of the reactions which lead to its suicide, it is expected that understanding the mechanism of Ap will allow us to develop new antitumor strategies.
Several flow cytometric methods have been developed to discern live cells from the cells which undergo Ap or N (reviews, 3-5). One group of the methods is based on analysis of DNA degradation and changes in chromatin structure which accompany Ap. Following fixation in ethanol or cell permeabilization with detergents, the degraded, low MW weight DNA is eluted from the cell. Ap cells are then recognized based on their reduced DNA-associated fluorescence as the cells with fractional DNA content (sub-G cells), while the degraded DNA extracted from the very same cells, can be analyzed by gel electrophoresis. Different DNA fluorochromes can be used to identify Ap cells, and these methods allow one to simultaneously estimate the cell cycle distribution of the nonapoptotic cell population. DNA staining can be combined with staining of RNA, total or specific protein, and bivariate analysis of such data provides additional information on cell populations.
In other group of methods the cells are prefixed with formaldehyde to crosslink DNA within the cell and 3'OH termini in DNA strand breaks in Ap cells are labeled with biotin-, digoxygenin-, FITC- or BODIPY- conjugated dUTP in the reaction catalyzed by terminal transferase (TdT) or DNA polymerase. A recent modification of this methodology, utilizing BrdUTP, which in turn is detected by FITC conjugated Brd MoAb, offers improved sensitivity over other methods of DNA strand break labeling (6). These methods are very specific to Ap cells, applicable for clinical samples and are especially useful for analysis the cell cycle phase specificity of Ap.
A novel method combining analysis of DNA replication (cell proliferation) and Ap in a single measurement was recently developed by us. In this method BrdUrd incorporation by DNA replicating cells is followed by photolysis and the DNA strand breaks induced by photolysis (SBIP) are then labeled with fluorochrome- conjugated dUTP by TdT. Ap cells, in turn, are recognized based on selective extraction of DNA (6).
DNA in Ap cells, compared to live interphase cells, is more sensitive to denaturation, which can be probed with the metachromatic dye acridine orange. Because DNA denaturability appears to correlate with chromatin condensation rather than with the presence of DNA strand breaks, this method may be of special use in atypical cases of Ap, when no extensive DNA degradation occurs.
Another group of methods is based on differences between Ap, N and live cells, in their ability to scatter light in forward and right angle direction, in plasma membrane permeability to such dyes as Hoechst 33342, 7-aminoactinomycin D or propidium iodide (PI), as well as the presence of functionally active mitochondria or lysosomes. One of the common assays of the cell membrane integrity employs the nonfluorescent esterase substrate, fluorescein diacetate (FDA). This substrate, after being taken up by live cells is hydrolyzed by intracellular esterases which are ubiquitous to different cell types; the product of hydrolysis, fluorescein is charged and thereby entrapped in the cell. The combination of PI and FDA results in live cells with intact plasma membrane staining green (fluorescein) and the cells with ruptured plasma membrane red (PI). The methods probing integrity of the plasma membrane and organelles are particularly useful to discriminate between Ap and N mode of cell death.
Plasma membrane phospholipids are asymmetrically distributed between the inner and outer leaflets of the plasma membrane and phosphatidylserine is located on the inner surface. The loss of phospholipid asymmetry leading to exposure of phosphatidylserine on the outer surface is an early event of Ap. Because the anticoagulant annexin V preferentially binds to phosphatidylserine, by conjugating FITC to annexin V it has been possible to use such a conjugate as a marker to identify Ap cells by flow cytometry (7).
One of the early events of Ap is a loss plasma membrane structures such as pseudopodia and microvilli, resulting in smooth appearance of cell surface. F-actin is a major constituent of pseudopodia and is being rapidly lost during Ap. The loss of F-actin can be detected by FITC conjugated phallotoxins, the toxic cyclic peptides which are used as a probe of F-actin. The method, therefore, was proposed to combine cell staining with FITC-phalloidin with DNA content analysis to identify Ap cells and to reveal the cell cycle position of both, Ap and nonapoptotic cell populations (8).
Advantages and limitations of the methods mentioned above will be discussed. Also, their clinical applicability to monitor chemotherapy of human leukemias will be presented.
References:
1. Wyllie A. Apoptosis and the regulation of cell numbers in normal and neoplastic tissue: an overview. Cancer and Metasasis Reviews. 11: 95- 103, 1992.
2. Kerr JFR, Winterford CM and Harmon BV. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 73: 2013 -2026, 1994.
3. Darzynkiewicz Z, Cytometry in cell necrobiology.: analysis of apoptosis and accidental cell death (Necrosis) Cytometry, 27: 1-20, 1997.
4. Telford WG, King LE and Fraker PJ. Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogenous cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Meth 172: 1-19, 1994.
5. Darzynkiewicz Z, Li X and Gong J. Assays of cell viability: Discrimination of cells dying by apoptosis.Meth CellBiol. 41: 16-37, 1994.
6. Li X and Darzynkiewicz Z. Labelling DNA strand breaks with BrdUTP. Detection of apoptosis and cell proliferation. Cell Prolif 28: 571-579, 1995.
7. Koopman G, Reutelingsperger CPM, Kuijten GAM, Keehnen RMS, Pals ST and van Oers MHJ. Annexin V for for cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, 84: 1415-1420, 1994.
8. Endersen PC, Prytz PS and Aarbakke J. A new cytometric method for discrimination of apoptotic cells and detection of their cell cycle specificity through staining of F-actin and DNA. Cytometry, 20: 162-171. 1995.
5. REGULATION OF CELL DEATH BY MEMBERS OF THE Bcl-2 PROTEIN FAMILY
K Newton. AW Harris, ML Bath, LA O'Reilly, LM Corcoran, KGC Smith, E Maraskovsky*, JJ Peschon*, M Teepe* and A Strasser
Molecular Genetics of Cancer Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, PO Royal Melbourne Hospitals Vic 30S0, Australia
* Immunex Research and Development Corporation, Seattle. WA 98101. USA
Apoptosis in mammals and the nematode Caenorhabditis elegans is regulated by proteins of the Bcl-2 family. Bcl-2 is the prototype of this family exhibits anti-apoptotic activity, and is the functional homologue of the Ced-9 protein which prevents programmed cell death in C. elegans. In mammals, several Bcl-2-related proteins have been identified and these can be subdivided into two groups on the basis of their ability to promote or suppress apoptosis. Recent experiments have provided evidence that Bcl-2 and Ced-9 function by preventing activation of the cysteine proteases (caspases) which effect the collapse of the cell.
The ability of Bcl-2 to block cell death is demonstrated in IL-7 receptor (IL-7R) deficient mice that express a bcl-2 transgene. T cell development is defective in IL-7R knockout animals but is completely rescued by lymphoid specific expression of Bcl-2. Analyses indicate that the pro-survial function of Bcl-2 maintains a population of immature T cells that depend on signals from the IL-7R for their survival.
Some developmentally programmed cell deaths occur by a mechanism that is not blocked by Bcl-2, an example being the deletion of self-reactive thymocytes, A subset of the TNF receptor family transduce death signals via the cytoplasmic adaptor molecule FADD/MORT1 in a manner that is not blocked by Bcl-2. The role of these receptors in T cell development and function was investigated in transgenic mice that express a dominant interfering FADD/MORT1 mutant.

=== IMAGE ANALYSIS ===


6. 3-D-ABBILDUNG, DATENREPRÄSENTATION UND FUNKTIONELLE SIMULATION VON BIPOLOGISCHEN MIKROSTRUKTUREN
PD Dr. Andres Kriete,
Bildverarbeitungslabor des Uni-Klinikums, Institut fur Anatomie und Zellbiologie, Giessen
Eine grosse Anzahl neuer bildgebender Modalitäten ermöglicht neue Einblicke in die Struktur und Funktion von Organen, Geweben, Zellen und Molekülen. Der besondere Fortschritt geht von der Kombination der Mikroskope mit Computern aus, um mikroskopische Bilder zu verarbeiten, zu analysieren und zu repräsentieren. Im Bereich der Verarbeitung von 3-D - Informationen sind neben den etablierten Visualisierungstechniken wie Oberflächen- und Volumendarstellung spezielle Algorithmen entwickelt worden, um an diesen Signalen effiziente Bildverbesserung, Restauration, Kodierung, Segmentierung und Identifizierung durchzuführen. Der Computer wird ebenfalls dazu herangezogen, um schon während der Datenaufnahme ein hohes Maß an Datenqualität sicherzustellen, die Strahlenbelastung zu minimieren und das Alignement und die Bildfusionsoperationen zu steuern.
Da Wachstum, Dynamik und Funktion die Eigenschaften lebender Organismen ausmachen, erlauben in-vivo - Abbildungstechniken 4-D - Informationen darzustellen. Solche Informationen können aber auch aus Computersimulationen gewonnen werden. Die neuen Formen der numerischen und physikalisch basierten Simulation erlauben eine enge Kopplung mit der grafischen Visualisierung. Das Studium von Form und Funktion eröffnet auch neue Wege zum Studium von Morphogenese. Der Einfluß von physikalischen Mechanismen wie Adhäsion, Kräften, Viskosität und Konvektion in Wechselwirkung mit genetischen Mechanismen kann untersucht werden.
Dieser Beitrag gibt einen Überblick über die historische Entwicklung in der mehrdimensionalen Bildverarbeitung. Der momentane Stand der Technik wird im Hinblick auf Anwendungen in der Biomedizin analysiert. Hierauf basierend werden zukünftige Entwicklungen abgeschätzt.
7. SPEKTRALE PRAEZISIONSDISTANZMIKROSKOPIE IN DER GENOMFORSCHUNG
C. Cremer*(1,2), H. Bornfleth (1), J. Bradl (1), P. Edelmann (1), A. Esa (1), H. Münch (1), J. Rauch (1), B. Rinke (1), L. Trakhtenbrot (3), M. Hausmann (1), T. Cremer (4,2) (1) Institut für Angewandte Physik & (2) Interdisziplinäres Zentrum für Wissenschaftliches Rechnen (IWR), Universität Heidelberg, D-69120 Heidelberg; (3) Institute of Hematology, Tel. Hashomer/Israel; (4) Institut für Humangenetik der Universität München, D-80333 München.
*vortragender Author
Es werden neue methodische Ansätze skizziert, mit Hilfe einer Kombination multispektraler molekularbiologischer Markierungstechniken mit neuen optoelektronischen Verfahren, wie der konfokalen Laserscanning Fluoreszenz-Mikroskopie oder der Quantitativen Laserstimulierten Wellenfeld-Fluoreszenzmikroskopie eine "spektrale Hochspräzisionsmikroskopie" jenseits der klassischen Auflösungsgrenzen der Fernfeldlichtmikroskopie "dicker", transparenter biologischer Objekte zu realisieren. Langfristig zeichnen sich damit Möglichkeiten ab, lichtmikroskopische Untersuchungen zur räumlichen Topologie des Genoms in dreidimensional konservierten ("intakten") Zellkernen mit molekularem Auflösungs"äquivalent" durchzuführen und damit zu einem vertieften Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehung des menschlichen Genoms beizutragen.
8. DREIDIMENSIONALE MEHRFARBEN-BILDREKONSTRUKTION ZUR UNTERSUCHUNG DER POSITION DER GENE ANT2 UND ANT3 AUF MENSCHLICHEN X-CHROMOSOMENTERRITORIEN.
Peter Edelmann, Harald Bornfleth, Steffen Dietzel, M. Hausmann, T. Cremer, C. Cremer
In normalen weiblichen (menschlichen) Zellkernen ist aus Gründen der Dosiskompensation eines der beiden X-Chromosomen inaktiviert [Lyon, M. 1961]. Es bietet somit die Möglichkeit zur Untersuchung, ob die morphologische und topologische Struktur von Chromosomenterritorien und deren funktionale Bedeutung in einem kausalen Zusammenhang stehen. Das Gen ANT 3 entgeht der Inaktivierung des einen X-Chromosoms, wohingegen das Gen ANT 2 auf dem inaktiven X-Chromosom (Xi) deaktiviert wird. Mikroskopische Untersuchungen dieser Genregionen nach Fluoreszenz in situ Hybridisierung ermöglichen es somit, ein und dieselbe Kopie eines Gens im gleichen Zellkern zum einen im aktiven und zum anderen im inaktiven Zustand zu betrachten. ANT2 und ANT3 auf Xi erlauben einen Vergleich eines aktiven und inaktiven Gens im gleichen Chromosomenterritorium [Dietzel, S. 1996].
Bei einer Reihe von Amnionzellkernen wurden die X-Chromosomenterritorien bzw. die ANT2 und ANT3 Genregionen mit verschiedenen Fluoreszenzfarben spezifisch markiert und Serien konfokaler Bildschnitte aufgenommen. Für die Bildauswertung werden geeignete Parameter und deren Bestimmung (Volumen, Oberfläche, Rundheitsfaktor und Smoothness) zur Untersuchung obiger Aufgabenstellung vorgestellt. Die Folgen chromatischer Aberrationen des mikroskopischen Systems auf die Ergebnisse von Mehrfarbenanalysen werden dabei korrigiert.
In Übereinstimmung mit [Eils, R. et. al 1996] zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen an menschlichen X-Chromosomenterritorien keine Unterschiede in den Volumina zwischen Xi und Xa. Allerdings weist das Xi bedingt durch seine rundere Form eine wesentlich kleinere Oberfläche auf. Weitere Unterschiede ergaben sich bei der Analyse von Rundheits- und Smoothnessfaktor.
Die Mehrfarbenanalyse der Position von ANT2 und ANT3 Genen auf menschlichen X-Chromosomen deutet auf eine verschiedene Lage von Genen auf aktiven und inaktiven Territorien hin. Das ANT2-Gen auf dem inaktiven X-Chromosom ist den vorliegenden Daten nach hochsignifikant tiefer im Territorium positioniert als auf dem aktiven X-Chromosom. Die Verteilung des ANT2-Gens auf Xi weicht dabei deutlich von einer Gleichverteilung ab.
Literatur:
Lyon, M. (1961): Gene action in the X-chromosome of mouse (Mus musculus L.) Nature 190 372-373
Dietzel, S. (1996): Untersuchungen z. Organisation v. Interphasechromosomen mittels Mehrfarben-Fluoreszenz in situ Hybrid Eils, R., S. Dietzel, E. Bertin, E. Schrock, M.R. Speicher, T. Ried, M. RobertNicoud, C. Cremer, and T. Cremer. (1996): T
9. COMBINATION OF SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS AND FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDISATION (FISH) TO DETECT UV-A RADIATION INDUCED DNA DAMAGE IN INDIVIDUAL HUMAN CELLS
C. Bock, H. Dittmar, H. Gemeinhard, K.-O. Greulich,
Institute for Molecular Biotechnology, Beutenbergstr. 11, D-07745 Jena, Tel./Fax:**49.3641.656405/1 0
UVA-light (320 nm - 400 nm) is assumed to cause DNA damage in biological cells, such as alkali-labile sites and single strand breaks by an indirect mechanism.
The single cell gel electrophoresis (comet assay) is a sensitive and rapid method for DNA detection of single strand breaks in individual cells, based on stretching and migration of DNA molecules in an electric field. The comet assay was applied to investigate UV-A radiation (365 nm) induced DNA damage in single human lymphocytes from peripheral blood. An increase in single strand break frequency with radiation fluence was observed. We could distinguish clearly between stimulated and unstimulated lymphocytes by their response to UV-A exposure.
With FISH it is possible to localise and visualise specific sequences within interphase nuclei and metaphase chromosomes. We evaluated a combination of both methods to obtain sequence specific informations within the UV-A radiation damaged and electrostrechted nucleus. For this purpose is was necessary to modify the FISH procedure as the cells were embedded in low melting agarose for the comet assay. We used chromosome 1 centromer specific digoxigenin labelled alpha-satellite probes. Detection was performed by fluorescence dye labelled antibody cascade to amplify the weak signal within the agarose gel. The cells were visualised with an epifluorescence microscope equipped with an intensified camera. For unstimulated lymphocytes approximately 90 % of the nuclei showed one single spot, which is in agreement with the fact that they are in cell cycles phase Go. We observed that the centromers are preferentially distributed in the exterior volume in G0 nuclei.
10. PLOIDY DETERMINATION ON THIN HISTOLOGICAL SECTIONS
a proposal for standardised tissue section DNA-measurements
A Gschwendtner, T Mairinger,
Dept.of Pathology, University of Innsbruck, Innsbruck, AUSTRIA
To obtain reliable results in ploidy determination performed on thin histological sections using mathematical correction algorithms, a standardised measurement protocol is necessary. This protocol contains the exact determination of the thickness of the section under investigation, the choice of the appropriate correction algorithm and the use of a high magnification objective lens. Section thickness can be determined accurately by a simple method introduced recently by the authors. Different correction algorithms have been extensively tested on rat liver tissue as well as non-malignant human tissues. The value of these algorithms has further been proven on tissue sections of malignant human tissue. It could be demonstrated that the performance of the different correction algorithms depends on the thickness of the sections. In a medium range of thickness (5-6um), the algorithms of McCready and Haroske rendered correct results. It has to be pointed out that high magnification objective lens have to be used to exclude overlapping and highly fragmented nuclei which are not without doubt identifiable using lower magnifications. DNA measurements on thin histological sections are possible under standardised conditions.
Nevertheless up to now measurements on thin histological sections are more tedious than single cell measurements and therefore do not seem suitable for routine purposes.
11. ZEITLICHER VERLAUF DER INDUKTION DER APOPTOSIS UND DES ZERFALLS DER APOPTOTISCHEN ZELLEN NACH CAMPTOTHECIN UND ETHANOL EINWIRKUNG
H. Baisch,
Institut für Biophysik und Strahlenbiologie, Universität Hamburg
Die Induktion von Apoptosen in HL-60 Zellen wurde mit Camptothecin (1.5 uM) und Ethanol (3 %) über 72 h verfolgt. Die Messungen wurden mit Methoden durchgeführt, die unterschiedliche Veränderungen in den apoptotischen Zellen registrieren. Membranveränderungen wurden mit Propidium Jodid (Pl) und mit V-Annexin + Pl erfaßt; Strukturveränderungen im Chromatin lassen sich mit Acridin-Orange-Färbung nach Säurebehandlung nachweisen; die enzymatische Degradierung der DNA haben wir mit der Sub-G1-Gipfel Methode nach Pl Färbung in erhöhter Phosphatkonzentration sowie der TUNNEL-Methode gemessen. Obwohl die Membranveränderungen als erste registriert wurden, gefolgt von Chromatinstrukturveränderungen und DNA-Degradation, folgten sie einander mit nur geringen Zeitdifferenzen (1 bis 2 Stunden).
Um den Abbau der apoptotischen Zellen zu beobachten, haben wir in einer weiteren Experiment-Serie die Induktion auf 4 Stunden begrenzt und danach die Zellen in frischem Medium suspendiert. Nach Ethanol-Induktion ergaben sich 40% Apoptosen, die mit einer Halbwertszeit von 35 Stunden abgebaut wurden. Die noch vitalen Zellen begannen nach 8 Stunden wieder mit der Proliferation. Die Camptothecin Behandlung induzierte zunächst nur bei den S-Phase-Zellen Apoptosis, aber nach etwa 10 Stunden begannen die G1-Phase-Zellen in die S-Phase überzugehen und wurden dort sogleich apoptotisch. Die intrazellulären Prozesse lassen offenbar eine relativ lange Lebensdauer apoptotischer Zellen zu. In Geweben wird sie durch Phagozytose extrem verkürzt.
12. APOPTOTIC DNA FRAGMENTATION IS ATTENUATED BY AMILORIDE, AN INHIBITOR OF THE NA+ / H+ TRANSPORTER
H. Crissman, B. Sailer, J. Cobo*, R Garcia-Canero*, J. Valdez ,and A. Barrasso,
Los Alamos National Laboratory, Life Sciences Division, Los Alamos, NM 87545, USA, * Universidad de Alcala de Henares, Alcala de Henares, 28871 Madrid, Spain
Amiloride is a K+ sparing diuretic that inhibits the Na+ / H+ transporter in the plasma membrane of most mammalian cells. Amiloride delayed the progression of apoptosis in HL-60 cells induced by camptothecin (CAM), cycloheximide (CHX) and 20 Gy gamma irradiation. Flow cytometric cell cycle analysis, combined with DNA strand break analysis indicated that amiloride diminished endonuclease degradation induced by CAM or CHX, and prevented degradation for 3 h following gamma radiation.
Protection from apoptosis was also observed 5 h after irradiation, but at a decreased level. Amiloride also effectively reduced the S and G2 phase checkpoint responses induced by 2.5, 5.0 and 7.5 Gy of gamma radiation without apparent cell death over a 24 h period. Immunofluorescent quantitation of cyclin B1 levels demonstrated that amiloride significantly reduced cyclin B1 expression following 5.0 Gy, when there was a significant G2 delay, followed by rapid recovery of cycling potential. Results suggest that amiloride affects the radiation-triggered signaling cascades and alters kinase activity associated with mitotic progression. Alternatively, alterations in intracellular ion concentrations induced by amiloride may lead to changes in Ca2+ dependent signaling cascades, and thereby decrease the radiation-mediated cell cycle perturbations.
Supported by the US Department of Energy and the Los Alamos National Flow Cytometry Resource (NIH Grant p41-RRO1315) and NIH Grant RO1 RR06758.
13. NEW APPROACHES IN ANALYSIS OF CELL CYCLE
Zbigniew Danynkiewicz
The Cancer Research Institute, New York Medical College, Valhallaf N. Y. 10593. USA.
Cyclins are key components of the cell cycle progression machinery. They activate their partner cyclin dependent kinases (CDKs) and target them to respective substrate proteins within the cell. CDK-mediated phosphorylation of specific sets of proteins drives the cell through particular phases or checkpoints of the cell cycle. During unperturbed growth of normal cells, the timing of expression of several cyclins is discontinuous, occurring at discrete and well defined periods of the cell cycle. Immunocytochemical detection of cyclins in relation to cell cycle position (DNA content) by multiparameter flow cytometry has provided new possibilities in analysis of the cell cycle. Thus, expression of cyclin D also may serve to discriminate Go vs. G1 cells, and as an activation marker, to ide Bivariate analysis of cyclins expression vs. DNA content like no other method, can be used to detect the unscheduled expression The status of phosphorylation of histone H3 which can be probed by a newly developed antibody provides an additional landmark de
14. DER EINFLUß VON ZELLKULTURBEDINGUNGEN AUF DEN ZELLZYKLUS UND DIE STRAHLENEMPFINDLICHKEIT. / THE INFLUENCE OF CELL CULTURE CONDITIONS ON THE CELL CYCLE AND RADIOSENSITIVITY
D. Bartkowiak, W. Nothdurft, E.M. Röttinger
Abteilung für Strahlentherapie der Universitätsklinik, Robert Koch Str. 6 D 89081 Ulm
Die Bedeutung des Zellzyklus für eine Vielzahl zellbiologischer Leistungen ist bekannt. Aus Klonogenitätsassays mit synchronisierten HeLa- und Chinesischen Hamster Zellen liegen Daten über die Strahlenempfindlichkeit der verschiedenen Zellzyklusphasen vor. Bei strahlenbiologischen Untersuchungen an asynchronen Populationen werden allerdings üblicherweise keine detaillierten Angaben zur jeweiligen Zellzyklussituation gemacht. Wir untersuchen, welchen Einfluß der durch Kulturparameter wie Temperatur, Serumgehalt und Populationsdichte beeinflußte Zellzyklus auf die Strahlenempfindlichkeit asynchroner Zellen hat.
The importance of the cell cycle for a large number of biological parameters is known. The radiosensitivity of different cell cycle phases has been studied in clonogeneity assays with synchronized HeLa and Chinese hamster cells. However, in radiobiological experiments with asynchronous populations, data on the actual cell cycle distribution are usually not included. We examine the influence of the cell cycle on cellular radiosensitivity by altering culture conditions such as temperature, serum content and population size in asynchronous cells.
15. FLUORESCENCE ENHANCEMENT OF DNA BOUND TOPRO-3 BY INCORPORATION OF BROMODEOXYURIDINE TO MONITOR CELL CYCLE KINETICS
Beisker W, Weller-Mewe EM1) and Nüsse M
GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Durchflußzytometrie, Ingolstädter Landstr. 1, 85764 Neuherberg,
1) Institut für Strahlenhygiene, Bundesamt für Strahlenschutz, 85762 Oberschleißheim
The use of TOPRO3 in a new staining technique for detection of BrdUrd substitution of DNA in mammalian cell lines by dual laser flow cytometry has been investigated. The fluorescence emission of external bound TOPRO3 is considerably enhanced by incorporation of BrdUrd in the DNA. Combined with the DNA intercalating dye propidium iodide (Pl) as a total DNA stain, cell cycle analysis of mammalian cells can b The staining protocol is based on a classic nuclei extraction technique avoiding cell loss and clumping. Cell cycle studies of human SCLII keratinocytes and mouse 3T3 cells prove the method to be as general applicable as the classical BrdUrd/Hoechst quenching technique but without the need for expensive UV laser excitation.
16. TIME RESOLVED ANALYSIS OF Ki-67 EXPRESSION DURING THE CELL CYCLE OF ASYNCHRONOUSLY GROWING UROTHELIAL CELL LINES
E. Endl1, P. Rudolph2, R. Knüchel1 and F. Hofstädter
1 Institut für Pathologie, Universität Regensburg.
2 Institut für Allgemeine Pathologie, Universität Kiel.
Flow cytometric multiparameter analysis of the proliferation associated antigen, Ki-67 (MIB1 antibody, Dianova) was combined with cell kinetic analysis, achieved by continuous labeling with bromodeoxyuridine, followed by staining with Hoechst33258. We could demonstrate that a dissection of the history of cell replication, obtained by the BrdU/Hoechst technique combined with immunofluorescence techniques reveals detailed information about the time dependent regulation of the Ki-67 staining intensity especially during the G1 transit of the cell cycle.
Postmitotic G1 cells show a strong intensity of the antibody staining. The antibody reactivity declines within 3-4 hours after mitosis, but the cells remain "positive" during the rest of the G1 phase. Ki-67 "negative" cells appear at the end of the G1 phase. These results are in contrast to experiments performed on stimulated peripheral blood lymphocytes or synchronized cells and may reflect functional changes of the antigen due to the cell cycle regulation in unperturbed and asynchronously growing urothelial cell lines.
Utilizing monoclonal antibodies to the various cyclins or recently described proliferation associated antigens (Ki-S2), this technique can be extended to elucidate checkpoints in various phases of the cell cycle, and therefore can help to understand tumor-specific cell cycle progression.
17. DNA FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS OF HUMAN SEMEN SAMPLES
Hacker-Klom U.B., Neugebauer D.-Ch., Göhde W., Nieschlag E. and Behre H.M.,
University of Münster Germany
We present evidence that DNA flow cytometry adds quantitaive information in semen analysis not easily gained by other methods and suggest application in the diagnosis of male infertility. The patients were attending the Clinic because of infertility problems, Ejaculates of 171 patients were analysed by DNA flow cytometry and conventional light microscopic semen analysis. In addition, to find morphological correlates in the special questions of diploid spermatozoa and disturbance of chromatin condensation, electron microscopy was applied. The DNA histograms obtained by flow cytometry of DAPI stained cells were analysed with respect to the percentages of signals registered within the sub-haploid region (debris), in the 1cc peak (mature haploid spermatozoa), the 1c area (haploid round spermatids), the 2cc peak (diploid spermatozoa), and the greater than 2cc area; the 2c peak (leukocytes, spermatocytes etc.). S phase and 4c cells. Eight classes of DNA histograms were obvious by flow cytometric measurements and correlated with the results of the spermiograms as concerns quantity and quality of seminal cells. Flow cytometry adds quantitative information to results of spermiograms about the condensation of chromatin and the occurrence of abnormal diploid spermatozoa.
18. CELL SURFACE EXPOSURE OF PHOSPHATIDYLSERINE CORRELATES WITH STAGE OF FLUARABINE INDUCED APOPTOSIS IN CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA (CLL)
Kay Oliver Kliche, Katharina Clodi, Uqo Consoli, Douq Weidner, Virginia Snell, Michael Andreeff.
Department of Hematology, Section of Molecular Hematology and Therapy, MD Anderson Cancer Center, Houston / Texas, USA.
Programmed cell death (PCD) is characterized by a sequence of events that result in activation of caspases and in internucleosomal DNA cleavage. This timing of discrete events is tightly regulated. Late apoptotic events such as DNA-strand breaks can be assayed by in situ labeling (ISEL) and sub G1 DNA content measurement (sub G1) by flow cytometry. Active phosphatidylserine (PS) redistribution from the inner plasma membrane leaflet to the outer leaflet, an early event in PCD, can be demonstrated utilizing a PS-binding protein, annexin V (AxV). AxV-FITC staining results in variable brightness appearing as AxV-negative (AxVnes), AxV low positive (AxV10) and AxV high positive (AxVhi) populations. Aims of this study were a) comparison and quantitation of three established methods detecting apoptosis (AxV-binding, ISEL and sub G1 DNA content assessment using acridine orange) and b) correlation of brightness of Annexin V-FITC stained cells with stages of apoptosis. As an in vitro model chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured with fludarabine were used. Populations were separated by FACS- sorting and reevaluated comparing the different assays. Only AxVhi correlated with ISEL and sub G1 (AxVhi after sort 94 + 0.6 % vs. 88.6 + 6.6 % vs. 98.6 + 0.6 %) meaning that a late apoptotic stage is equally detected by the 3 methods. Of AxV10, being reassessed after sorting, ISEL revealed only 21 + 13 % and sub G1 20 + 6.6 % apoptotic cells suggesting that AxV reveals apoptotic cells at a stage too early to be to be found by those tests. We conclude that a) AxV is more sensitive in detecting apoptotic cells than sub G1 or ISEL, b) not AxV positive but AxVhi only must be used for direct comparison to sub G1 and ISEL and c) AxV is a valuable tool to detect and sort apoptotic cells at different stages for further studies of the dynamics in PCD.
19. IST DIE DNA-PLOIDIE VON TUMORZELLEN IM ASCITES REPRESENTATIV FÜR DIE TUMORPROGRESSION BEIM SEROESEN OVARIALKARZINOM?
O. Reich, E. Petru, P. Pürstner
Geburtshilflich-gynäkologische Universitätsklinik Graz
Problemstellung:Tumorzellen aus dem Ascites von Ovarialkarzinomen werden in der gynäkologischen Onkologie fur Chemosensitivitätstestungen verwandt. Es ist jedoch fraglich, ob die DNA-Ploidie der Tumorstammlinie im Ascites sichere Rückschlüsse auf den Stand der zytogenetischen Progression im Primärtumor zuläßt. Durch einen Vergleich der DNA-Ploidie von Aszites und Primärtumor soll diese Frage beim serösen Ovarialkarzinom geklärt werden.
Material und Methode: Präoperativ aspirierter Aszites sowie 4-7 unmittelbar postoperativ entnommene Biopsien je Tumor von 18 serösen Ovarialkarzinomen wurden mittels hochauflösender Durchflußzytometrie untersucht. Fur die DNA-Analyse wurde ein PASIII Zytometer (Partec, Münster, BRD) eingesetzt. An mindestens 15.000 ZelIkernen je Probe erfolgte eine Färbung mit 4 ,6-diamidino-2-phenylindole nach Göhde. Zur Eichung des Gerätes und als interne Referenz dienten humane Lymphozyten. Der mittlere Variationskoeffizent (CV) fur sämtlich gemessene G0/G1-Peaks war <3%. Die Auswertung erfolgte mittels Multicycle Software (Phoenix Flow Systems, San Diego, California, U.S.A.). Ergebnisse: DNA-Aneuploidie konnte bei allen Aszitespunktaten festgestellt werden. Im einzelnen fanden sich 4 DNA-near diploide, 2 DNA-near tetraploide, 10 DNA-high aneuploide und 2 DNA-hypoploide Messungen. Die DNA-Ploidie der Stammlinie im Aszites konnte in 14 Fällen auch im Primärtumor nachgewiesen werden. In 10 Fällen repräsentierte die Stammlinie im Aszites die Probe der stärksten Abweichung des Primärtumors. In 8 Fällen fanden sich stärkere Abweichungen des DNA-Gehaltes im Primärtumor als im Aszites. In keinem Fall war die Änderung des DNA Gehaltes im Aszites ausgeprägter, als im Primärtumor.
Schlußfolgerungen: Beim serösen Ovarialkarzinom repräsentiert die DNA-Ploidie der Stammlinie im Aszites nur in einem Teil der Fälle die Stammlinie der stärksten DNA-Änderung im Primärtumor. Tumorzellen des Ascites sind deshalb nur eingeschränkt repräsentativ für die zytogenetische Tumorprogression des Primärtumors. Diese Tatsache muß bei der Beurteilung von Chemosensitivitätstestungen verstärkt berücksichtigt werden.
20. DNA-ZYTOMETRIE BEI BARRETT-OESOPHAGUS
A. Spiethoff, W.-R. Martin, K. Wegener
Pathologisches Institut des Klinikums der Stadt Ludwigshafen
Bei Patienten mit einem Barrett-Oesophagus ist das normale Plattenepithel durch ein Zylinderepithel ersetzt. Diese als Folge einer chronischen Refluxkrankheit auftretende Metaplasie stellt eine prämaligne Veränderung dar mit einem geschätzten Tumorrisiko von 10% aller Barrett-Patienten. Das Risiko ist besonders dann sehr hoch, wenn histologisch schwere Dysplasien des Barrett-epithels festgestellt werden.
Wir führen seit anderthalb Jahren DNA-zytometrische Untersuchungen bei Barrett-Patienten als Ergänzung und Kontrolle der subjektiven Dysplasiebeurteilung durch. Die Ploidiebestimmung der Feulgen-gefärbten Tupfpräparate erfolgt an einem Bildanalysesystem (CAS 200). Bei der Bewertung der DNA-Messungen wird die Position der Stammlinie (DNA-Index modal 0,90 - 1,10 = diploid) und die Einzlezellinterpretation (5 Zellen > 5c = aneuploid) herangezogen.
Bisher wurde bei 26 Barrett-Patienten eine Ploidiebestimmung in insgesamt 58 Proben durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Korrelation zwischen Ploidie und Dysplasiegrad. Bei einem negativen Dysplasiebefund überwiegen die diploiden DNA-Befunde (26 von 33 Proben), beim Vorliegen schwerer Dysplasien die aneuploiden (6 von 7 Proben). Eine Mittelstellung nimmt die Gruppe der leichten Dysplasien ein mit annähernd gleichen Häufigkeiten (10 diploide, 8 aneuploide Befunde). Bemerkenswert daran ist, daß bei immerhin 21% der dysplasienegativen Proben aneuploide DNA-Verteilungen gefunden wurden. Unser Beobachtungszeitraum ist zu kurz, um zu wissen, ob die Patienten (n = 6), bei denen bisher eine Aneuploidie, aber keine Dysplasie des Barrett-Epithels festgestellt wurde, Dysplasien entwickeln werden. Bei einer Patientin war dies jedoch bereits der Fall. Hier bestätigte eine Untersuchung zu einem späteren Zeitpunkt den aneuploiden Befund, gleichzeitig wurden histologisch leichte Dysplasien festgestellt.
21. HIGH EXPRESSION OF PHOSPHATIDYLSERINE (PS) IN MDS, SSECONDARY AML (SAML) AND NORMAL PROGENITORS: COMPARISON WITH PRIMARY AML (PAML)
K.O. Kliche and M. Andreeff,
UT MD Anderson Cancer Center, Houston / Texas, USA.
We previously reported that MDS and sAML cells are characterized by high expression of phosphatidylserine (PS), which has been identified as an early marker of apoptosis. We now extend this finding to a larger cohort of patients (n=65) and correlate apoptosis with other features such as cytogenetics. Bone marrow aspirates from 28 patients with MDS (RA=4, RARS=4, RAEB=6, RAEB-T=7, CMML=7) and 37 patients with AML (pAML=9, sAML=28) were studied. We also examined 12 normal BM samples. Lineage specific apoptosis was detected measuring PS-expression on the cell membrane through binding of Annexin V-FITC as an early marker of apoptosis combined with PE- and Tricolor-conjugated lineage-specific mAB against CD 33, CD 13, Glycophorin A, CD 41, CD 14 and CD 34. Overall PS-positivity was 53.4 + 6.0 % (mean + SEM) for MDS, 57.0 + 5.2 % for sAML and 14.7 + 3.6 % for pAML (all nucleated cells). Normal BM cells were positive in 28.0 + 1.9 %. The difference between the 3 groups (pAML, normal, MDS / sAML) was significant (p="0".001 to p="0".003). High PS expression was correlated with unfavorable cytogenetics (-5, -7, +8, complex abnormalities) (p = 0.003, t-test). Normal CD 34 cells also expressed high levels of PS positivity (52.3 + 7.7 %, n.s. compared to MDS (48.4 + 6.0 %) and sAML (50.3 + 4.6 %). However, PS positivity was lower in immature progenitors (CD 34++/ CD13-: 37.9 + 7.6 %) than in mature (CD 34dim / CD 13+: 70.3 + 3.4 %). A significant difference in PS positive CD 34++ cells was found between pAML (15.4 + 3.9 %) and sAML (53.2 + 3.9 %, p = 0.002, t-test).
Conclusion: 1. The increased expression of PS on differentiating as compared to immature CD 34 cells suggests a coordinated program of differentiation and apoptosis. 2. pAML and sAML express strikingly different levels of PS on their immature and mature cells perhaps suggesting different pathophysiologies. 3. sAML and MDS progenitor cells express similar PS levels suggesting that mechanisms other than apoptosis are involved in the transition from MDS to sAML. 4. Furthermore, high expression of PS in both, normal and MDS CD 34 cells, raises the possibility that there are no significant differences in apoptosis.
22. LOSS OF MITOCHONDRIAL FUNCTION IS ASSOCIATED WITH INCREASED ANNEXIN V BINDING TO PHERIPHERAL LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH SEVERE SEPSIS
C. Lindemann, S. Schröder1), A. Breuer, F. Stüber1), A. v. Rücker
Institut fur Klinische Biochemie und 1)Institut fur Anasthesiologie und Intensivmedizin, Bonn
Severe sepsis is associated with organ dysfunction which results from cellular malfunction on various levels. Cellular apoptosis can be induced by sepsis and the loss of cell membrane integrity plays a central role in this process. The upkeep of membrane lipid asymmetry is a sensitive marker of membrane integrity and can be monitored by Annexin V which binds to phosphatidylserine (PS) normally restricted to the cells' inner membrane. PS becomes available to Annexin V binding probably because the cells' main energy supply, i.e. the mitochondrial membrane potential (MMP), is impaired. The following results stress the importance of the MMP as an early indicator of cell membrane disruption (i.e. apoptosis) and Annexin V binding. In 7 patients with severe sepsis freshly prepared lymphocytes were analysed by flow cytometry. These displayed high Annexin V binding (mean: 18.7%, range: 7.7% - 32.6%) that increased in non-survivors during the course of the disease. An even higher percentage of Iymphocytes displayed cell shrinkage that indicates early cell apoptosis (37.1%, 34.0% - 42.4%). No Annexin V binding and cell shrinkage was observed in lymphocytes from normal individuals. The mitochondrial integrity was assessed by MitoTracker™, a new fluorescent mitochondrion-selective dye that stains mitochondria according to their MMP. This dye stained 52.7% to 61.8% (mean: 57.5%) of the lymphocytes from severe sepsis patients (normal individuals >97%). Cell shrinkage was characterized by a missing MMP (92.7%, 77.8% - 98.2%) indicating a loss of mitochondrial function. In conclusion our results show that severe sepsis induces a loss of MMP in a high percentage of circulating lymphocytes. Early signs of cellular apoptosis (i.e. cell shrinkage and Annexin V binding) were associated with mitochondrial dysfunction which probably also leads to organ dysfunction in severe sepsis.
23. LYMPHOCYTE AUTOANTIBODIES, ACTIVATION, PHAGOCYTOSIS AND APOPTOSIS IN THE IMMUNOPATHOGENESIS OF HlV-INFECTION
T. Nebe1, M. Müller1, G. Maier1, B. Buchholz2, F. Thienel3, J. Saur3. K. Friese4. M. Beichert4
1Inst.f. Klin. Chemie, 2Kinderklinik, 31. Med. Klinik and 4Frauenklinik, Klinikum Mannheim der Universität Heidelberg, D-68135 Mannheim
Flow cytometry as a flexible tool in cellular diagnostics has a major impact on the analysis of the immune phenomena that contribute to the destruction of the whole immune system in HIV disease.
The virological aspects of viral infection of various cells, the mutation rate and the initiation of replication are not sufficient to explain the long term pathogenesis of this disease. From early observations by Daniel et al. it became obvious that lymphocytes are coated with IgG antibodies and complement. We therefore wanted to elucidate the consequences of this immune response and analyzed the apoptosis and phagocytosis of lymphocytes fom HIV patients by macrophages compared to healthy persons. In addition we probed normal leukocyte functions like T cell activation, natural killer cell activity, phagocytosis of bacteria and oxidative burst. We found that the immune complexes originate from the viral glycoprotein gp120 that forms the viral knobs which are shedded by the virus and bound to CD4 cells. This in turn activates CD8 cells which subsequently induce apoptosis of CD4 cells. The strong CD8 response induced by viral replication is therefore disadvantageous.
The autoimmune phenomena increase during the progression of the disease as marked by decreasing CD4 counts however not in a linear fashion. There are waves that are triggered by viral replication which may lead to a phase specific immune suppression. In comparison the HIV infected chimpanzees who do not develop autoantibodies do not develop AIDS.
In summary this flow cytometric study revealed that the progression of HIV disease is associated with a strong autoimmune reaction against lymphocytes that leads to their elimination and an inhibition of normal leukocyte function.

=== KLAUS GOERTTLER AWARD ===


24. CYTOKINE EXPRESSION IN Th CELLS: PATTERN, KINETICS AND COMMITMENT
M. Assenmacher, M. Löhning*, A. Scheffold*, R. Manz*, S. Miltenyi, J. Schmitz and A. Radbruch*
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany
*Zentrum für molekulare Medizin, lnstitut für Genetik der Universität zu Köln und Deutsches Rheumaforschungszentrum Berlin, Germany
Th-cells play a central role in the regulation of an immune response by expression of different cytokines.
Using intracellular immunofluorescence of fixed and permeabilised cells we have analysed, whether individual Th- cells coexpress different cytokines in obligatory patterns (Th1/Th2). We found that the cytokines IL-2, IL4, IL-5, IL-10 und IFN-gamma (IFN-g) are independently expressed and regulated in individual T-cells from mouse and man - for optimal calibration of an immmune response.
But we also found, that different, even antagonistic cytokines can well be coexpressed for efficient initiation and limitation of a Th-cell response. In an inflammatory immune reaction, induced by the bacterial superantigen SEB, individual activated Th-cells can control their own function by sequential production of IL-2, IFN-g und IL-10.
The isolation of live Th-cells according to their cytokine expression and their functional analysis for sequential expression of other cytokines was enabled by the new cellular affinity matrix technology. However IFN-g- expressing Th-cells could also be isolated according to a specific cell surface marker - IFN-g - using a sensitive staining reagent, namely magnetofluorescent liposomes.
The differential expression of cytokines, especially of IFN-g or IL4, can be critically involved in immune diseases. We have analysed, based on the isolation of viable IFN-g expressing Th1 cells, the commitment of individual Th1 cells to expression of IFN-g vs. IL4 and IL-10. Upon recall stimulation with IL-4 after 1 week of Th1 differentiation with IL-12, some Th1 cells stopped expression of IFN-g and started to produce IL4 and/or IL10. Other cells were already committed to a proinflammatory, Th1-like phenotype. Many cells responded by expressing neither IFN-g nor IL4, but IL10. Thus expression of IFN-g is not coupled to commitment to production of IFN-g. Upon time of Th1 well differentiation inducibility of IL4 expression is lost earlier than inducibility of IL10 expression and IFN-g suppression in response to IL4, which might reflect different thresholds or alternative pathways for induction of IL4 versus IL10 by IL4.

=== STANDARDISATION AND QUALITY CONTROL ===


25. ERGEBNISSE DES RINGVERSUCHS 1997 ZUR STANDARDISIERUNG UND QUALITAETSSICHERUNG DER DURCHFLUßZYTOMETRISCHEN DNA-MESSUNG.
Friedrich J. Otto, Knüchel, Ruth, Ulrike Westhoff
Fachklinik Hornheide, Abteilung für Tumorforschung, 48157 Münster und Institut für Pathologie, Universität Regensburg, 93051 Regensburg
Der sechste Ringversuch zur Standardisierung und Qualitätssicherung der durchflußzytometrischen DNA-Messung wurde mit Unterstützung der Deutschen Gesellschaft für Zytometrie im Januar 1997 durchgeführt. 45 Labors erhielten die Testproben zugesandt; 36 Labors führten die Messungen durch und schickten auswertbare Daten zurück.
Die Ergebnisse dieses Ringversuchs bestätigen die in den früheren Versuchen gewonnenen Erkenntnisse. Die Meßwerte und die aus den Histogrammen abgeleiteten Daten zeigten eine erhebliche Streuung. Die Ursachen dafür liegen, das läßt sich aus den Erkenntnissen der bisherigen Versuche folgern, vor allem in der Verschiedenheit der benutzten Präparations- und Färbemethoden sowie in der unterschiedlichen Arbeitsweise und Einstellung der Instrumente. Durch Standardisierung der Färbemethoden mit Hilfe eines vorgegebenen Färbeprotokolls und Überwachung der instrumentellen Parameter mit Hilfe gefärbter und fixierter Standardzellen läßt sich eine deutliche Verbesserung der Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit erreichen.
Um den EinfluB der Auswerteprogramme zu erfassen, wurden die Originaldaten einiger Labors mit ein und demselben Programm analysiert. Die Resultate sind fur eine statistisch gesicherte Bewertung noch nicht ausreichend. Die Analysen sollen weitergeführt werden. Im diesjährigen Ringversuch wurden zum ersten Mal Proben und Reagenzien für eine kombiniert DNA- und Zytokeratin-Färbung angeboten, um Ansätze für die Standardisierung und Qualitätskontrolle von Zwei-Parameter-Messungen zur Tumorzellselektion zu erarbeiten. Auch diese Versuche müssen fortgesetzt werden.
26. GERMAN PROFICIENCY TESTING PROGRAM (INSTAND): " CD34-EXPRESSING CELLS "
Stefan Serke,
Virchow-Klinikum der Humboldt-Universität, Abtig. Innere Medizin und Poliklinik, Hämatologie-Onkologie, Augustenburger Platz 1,13353 Berlin, Germany
It is now well recognized that the measurement of CD34 expressing haemopoietic cells is of crucial importance in the setting of peripheral blood stem- and progenitor-cell transplantation. First, numbers of circulating CD34+ cells predict the numbers of cytapheresis-harvested CD34+ cells. Second, numbers of harvested, and hence transplanted CD34+ cells correlate fairly well with haemopoietic recovery-time. Thus, CD34+ cells are a diagnostic parameter, and there is need for proficiency testing.
I have organized, on behalf of INSTAND e.V., a proficiency testing survey for the assessment of CD34+ cells. To 58 laboratories, 2 EDTA-blood samples were sent out. Modified stabilized KG1 a cells, marketed now as StemTrol Cells (Coulter-Immunotech) were present in these samples at low content (sample-A: 0,5 %; sample-B: 0,25%). With complete answers from 44 laboratories, the mean values of all these participants were 0,49% and 0,26%. The respective coefficients of variation (CV) were 75% and 85%, respectively.
The absolute numbers determined were 11 CD34+ cells/ul and 5 CD34 cells/ul, respectively (CV 90% and 105%).
StemTrol Cells spiked into normal blood can be used for proficiency testing for the parameter " CD34-expressing cells".
27. FLOW-CYTOMETRIC QUANTITATION OF ABSOLUTE NUMBERS OF BINDING-SITES TO MONOCLONAL ANTIBODIES USING BEADS WITH DEFINED ANTIBODY-BINDING CAPACITY
Ameli Kruse & Stefan Serke,
Virchow-Klinikum der Humboldt- Universität, Abtlg. Innere Medizin und Poliklinik, Hämatologie- Onkologie, Augustenburger Platz 1, 13353 Berlin, Germany
There are two techniques available allowing for determination of absolute numbers of cellular binding-sites to monoclonal antibodies. Whereas the QlFI-beads are designed for indirect immunofluorescence, the QSC-beads are designed for direct immunofluorescence.
We have compared both techniques, focussing on one Ct>45monoclonal antibody, and the expression of the CD45-antigen on Iymphocytes, monocytes, and neutrophils, and focussing on a series of class-I, -II, and -Ill CD34- monoclonal antibodies and the expression of the respective epitopes on physiological and neoplastic circulating CD34+ cells. Also we have determined the effects of three red blood cells Iyse-reagents (RBC-LR) commercially available. Cytometer-settings were calibrated with monosized fluorescent beads.
There were large discrepancies between determinations with QlFI-beads and determinations with QSC-beads. These differences did not follow any rule, for example numbers of binding-sites to CD45-monoclonal antibody on lymphocytes were 200 000 (QlFI-beads) and 190 000 (QSC-beads), whereas the respective numbers on neutrophils were 45 000 (QIFI-beads) and 90 000 (QSC-beads). Measurements on 3 different FACScan devices, however, yielded identical results. The effects of RBC-LR were extreme, and one of those reagents abrogated binding of CD34-monoclonal antibody.
There is no comparability of numbers of binding-sites to monoclonal antibodies as determined by QlFI-technology and by QSC-technology. RBC-LR have extreme effects on the binding of monoclonal antibodies, as they partially destroy the relevant epitop.
28.VORTEILE EINER FLUßZYTOMETRISCHEN METHODE DER THROMBOZYTENZÄHLUNG
J. Neumüller1 und W. R. Mayr2
1Ludwig Boltzmann Institut fur Rheumatologie and Balneologie2 Wien-Oberlaa
2Blutspendezentrale des Roten Kreuzes für Wien, Niederösterreich und Burgenland, Österreichisches Rotes Kreuz
Die automatische Zählung von Thrombozyten (PLT) mittels elektronischer Partikelzählgeräte ist häufig relativ ungenau, wenn man bedenkt, daß unterschiedliche Hämocounter differierende Meßergebnisse liefern. Sehr auffällige Zählunterschiede ein und derselben Probe werden erhoben, wenn sehr geringe PLT Zahlen (in PLT depletiertem Plasma oder in filtrierten Erythrozytenkonzentraten), aber auch sehr hohe PLT-Zahlen (in PLT-Konzentraten) gemessen werden sollen. Weiters kann das Auftreten von kleinen aber auch von großen PLT- Aggregaten die PLT-Messung verändern.
Wir haben eine flußzytometrische (FC) Methode entwickelt, bei der die PLT mit monoklonalen Antikörpern gegen HLA-Klasse I Moleküle (FlTC-konjugiert) und gegen CD41 (PE-konjugiert) doppelmarkiert werden. Das aquirierte Flüssigkeitsvolumen wird durch eine definierte Anzahl fluoreszierender Kalibrierungskügelchen, die der Probe zugefügt werden, bestimmt. Auf diese Weise können intakte PLT durch doppeltes "Gaten" in den Punkthistogrammen FSC x SSC und FL1 x FL2 unter Verwendung der Attraktor-Software (Becton & Dickinson, USA) identifiziert werden. Zusätzlich wurde das Auftreten von PLT-Aggregaten mittels Video- unterstützter Bildanalyse untersucht.
Weiters wurden die FC-Meßergebnisse mit denen von Hämatocountern verglichen, die entweder nur eine Einparametermessung (Impedanzmessung nach dem Coulter-Prinzip) oder eine Kombinationsmessung aus zwei Parametern ermöglichen (Impedanzmessung und 20° Streulichtmessung, Abbot-Prinzip).
Die Vergleichsmessungen zeigten, daß nur die FC-Methode eine lineare PLT-Messung über einen Bereich von 10-107 PLT/ul ermöglicht. Aufgrund des "Doppelgatens" können die PLT sauber von anderen Blutzellen, aber auch von Zellschrott diskriminiert werden.
Die PLT-Zählergebnisse in PLT-Konzentraten, die mit der Abbot-Methode erhalten worden waren, ergaben eine hohe Konkordanz zu den FC-Werten. Ungünstigerweise waren die PLT-Zählungen mit der Abbot-Methode nur in Bereichen, die eine Zahl von 104 PLT/ul überschritten, linear.
Die Zählwerte, die mit der Coulter-Methode erzielt wurden, lagen deutlich unter denen der beiden anderen Geräte. Diese Messung versagte bei Zahlen kleiner als 103 PLT/ul.

=== PERIPHERAL BLOOD AND BONE MARROW ===


29. A MORE MATURE PHENOTYPE OF BLOOD MONONUCLEAR PHAGOCYTES IS INDUCED BY LIPID LOWERING THERAPY IN HYPERCHOLESTEROLEMIA
A. Herr1, J. Stöhr1, C. Abletshauser2, G. Rothe1, G. Schmitz1
1Institute for Clinical Chemistry, University of Regensburg, D-93042 Regensburg, 2Novartis Pharma GmbH, D-90327 Nürnberg
Mononuclear phagocytes play an important role in lipoprotein metabolism and the pathogenesis of atherosclerosis. We recently were able to demonstrate in peripheral blood associated to the apo E4 allele an increased proportion of mononuclear phagocytes which similar to alveolar macrophages show high expression of Fcy-Rlila (CD16) but only dim expression of the LPS receptor (CD14) (Arterioscler Thromb Vasc Cell Biol 16: 1437, 1996). In this study, the HMG-CoA-reductase inhibitor fluvastatin (40 or 80 mg) was compared against diet alone for potential effects on the phenotype of peripheral blood monocytes by flow cytometry in a double-blind, randomized, placebo -controlled, multi-center study. At baseline, in the 48 hypercholesterolemic patients the population size of these more mature monocytes (CD14dimCD16+) was positively correlated to total serum cholesterol levels (p="0".012) confirming our previous study. Fluvastatin treatment for 52 weeks was associated with a reduction in total cholesterol (-15,3 %) and the population of less differentiated monocytes (CD14bri9htCD16-) (p="0".000) but a selective increase of the population of "pre-macrophages" (CD14dimCD16+) (p="0".029). A decreased expression density of CD14 on monocytes (p="0".027) further confirmed this modification of the phenotype of peripheral blood monocytes. In summary, fluvastatin treatment over 52 weeks results in the relative decrease of less differentiated monocytes and an expansion of more mature monocytes, which are also characterized by a higher expression of ß1- and ß2-integrins. The positive correlation of this monocyte subset to the serum cholesterol concentration prior to but not following therapy indicates that this effect is independent of the change of serum lipids. Fluvastatin in conclusion exerts a yet uncharacterized immunomodulatory effect on either monocyte maturation and differentiation, or extravasation which also may depend on the endothelial phenotype.
30. DIFFERENTIAL EXPRESSION OF LIPOPROTEIN AND SCAVENGER RECEPTORS ON SUBPOPULATIONS OF MONONUCLEAR PHAGOCYTES
G. Schindler, J. Stöhr, G. Rothe, G. Schmitz
Institute for Clinical Chemistry, University of Regensburg, D-93042 Regensburg
Mononuclear phagocytes (MNPs) play an important role in lipoprotein metabolism and the pathogenesis of atherosclerosis. In peripheral blood, subpopulations of MNPs with a high phagocytic capacity, dim expression of the LPS-receptor (CD14) and bright FcgRIII (CD16a) expression can be discriminated by flow cytometry together with a subpopulation of cells with a high expression of HLA-DR and CD40 related to cellular antigen presentation from the predominant phenotype of monocytes characterized by bright expression of CD14. This study should to contribute to the yet unclear correlation of the cellular metabolic to the immunological differentiation of subpopulations of MNPs. Therefore, lipoprotein receptors such as the LDL-receptor, the LDL-receptor related protein (LRP, CD91) and the scavenger receptors (class A: SR-AI/II, class B: CD36, SR-BI) were analyzed in correlation to markers defining monocyte subpopulations ex vivo and during in vitro differentiation into macrophages. For lipoprotein receptor analysis Dil labeled LDL or acetylated LDL (acLDL) respectively monoclonal (CD36, CD91 ) and polyclonal (LDL-R, SR-BI) antibodies were used.
The CD16 positive subset of monocytes showed a relatively higher acLDL uptake, SR-BI and at the same time LRP expression when compared with the predominant phenotype of CD16 negative and CD14 bright MNPs. The antigen presenting subset, in contrast, showed a decreased expression of all lipoprotein and scavenger receptors analyzed. During up to 7 days of serum-free in vitro differentiation of MNPs in presence of M-CSF an already early increased expression of all scavenger receptors occurred at the same time as the increase of the CD16. Enhanced synthesis of apoE, as analyzed intracellulary in permeabilized cells, in contrast, was a later event associated to cellular differentiation. In summary, these results show a tight correlation of cellular lipid uptake and metabolism to the phenotype of different subpopulations of phagocytosing and antigen-presenting peripheral blood MNPs as well as to their immunonogical in vitro differentiation.
31. FLOW CYTOMETRIC CHARACTERIZATION OF DISINTEGRIN INTERACTION WITH THE PLATELET FIBRINOGEN RECEPTOR
G. Rothe, K. Wittig, G. Schmitz
Institute for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, University of Regensburg, D-93042 Regensburg
Conformational activation of platelet Gpllb/llla coupled to increased affinity for binding of soluble fibrinogen is important in platelet aggregation. Antibodies, peptides, and small molecules which antagonise fibrinogen binding, therefore, have been developed as a new class of potent anti-aggregatory compounds. The binding of these artificial ligands, however, similar to fibrinogen binding may also stimulate platelet adhesion and degranulation. Therefore, in this study effects of MK-852, a cyclic hexapeptide based on the RGD-template, on the platelet phenotype were analysed by whole blood flow cytometry. MK-852 already in the nanomolar range completely inhibited the surface binding of fibrinogen to ADP or TRAP-6 stimulated platelets. In the micromolar range, MK-852 induced an up to four-fold increase of Gpilb/lila surface expression in the absence of increased P-selectin expression. In conclusion our results suggest that the selective surface recruitment of Gpilb/lila may be a side effect of exposure to RGD-analogues which occurs at concentrations well above optimal inhibition of fibrinogen binding.
32. DURCHFLUßZYTOMETRISCHE ANALYSE VON ANTIGENEN PEPTIDEN AUF ANTIGEN-PRÄSENTIERENDEN ZELLEN
D. Kunkel, A. Scheffold und A. Radbruch,
Deutsches Rheuma- Forschungszentrum Berlin
Zur Steuerung einer Immunreaktion müssen T-Helfer Lymphozyten ihr spezifisches Antigen in Form antigener Peptide erkennen, die von Antigen- präsentierenden Zellen prozessiert und auf MHC Klasse Il-Molekülen präsentiert werden.
Unter Verwendung eines haptenisierten Ovalbumin-Peptides haben wir die Präsentation dieses Peptides durchflußzytometrisch untersucht. Die spezifische Bindung des Peptides an das MHCII-Molekül wurde nachgewiesen. Weiterhin wurden die für die Aufnahme und Präsentation notwendigen Bedingungen sowie der Zusammenhang zwischen Peptidkonzentration und Anzahl der beladenen MHCII-Moleküle pro Zelle ermittelt.
Unsere Ergebnisse zeigen, daß mittels Durchflußzytometrie der Nachweis und die Separation Antigen-präsentierender Zellen anhand der Präsentation spezifischer Peptide möglich ist.
33. MEASUREMENT OF PLATELET ARTERIAL INTERACTIONS USING MODIFIED PLATELET FUNCTION PROTOCOL AND DUAL LASER FLOW CYTOMETRY
Almut Mahnke, Rainer Zotz,Thomas Kunze, Attila Tarnok
Heart centre Leipzig, University Hospital, University of Leipzig, Germany
Activated platelets are known to play an essential role in the pathogenesis of thrombosis. Based on a protocol by G. Rothe for the analysis of platelet activation in whole blood (in: M.Nusse (ed.), Chapter 10, Handbuch zum 2. Zytometriekurs, GSF-Neuherberg, Juni 1996) we are currently studying the changes in platelet activation induced by mechanical stress, coronary heart disease (CHD) and treatment of rat aorta. Human blood was led through various materials such as syringes, rat aortas and metal implants, was analysed immediately afterwards and compared with untreated blood (results see table). Using dual laser flow cytometry we were able to simultaneously measure platelet activation, aggregation and adhesion by measuring following parameters: agranule GMP-140, which mediates adhesion to neutrophils and monocytes (CD62P-FITC), fibrinogen receptor GP IIb/IIIa to identify the platelets (CD41aPE) and to detect increased affinity to its ligand (polyclonal Fibrinogen-FITC), v. Willebrand receptor GP lb (CD42b) and pan leukocyte antigen (CD45-APC). Measurements with CD41 a/CD62P/CD45 compared to the same assay measured without CD62P demonstrate that CD62P totally blocks the plateletleukocyte adhesion. Measuring CD42b/CD45/Fibrinogen in one assay and measuring another assay without Fibrinogen we found a co-stimulating effect of Fibrinogen to ADP and TRAP-6 stimulation therefore we did not use information about platelet-leukocyte adhesion from this assay. Currently we use for stimulation ADP or TRAP-6 and 1. CD41 a-PE/CD45-APC and for CD62P, CD42b expression and fibrinogen binding 2. CD41a-PE /CD 62P-FITC, 3. CD42b-PE / Fibrinogen-FITC. healthy volunteer syringe rat aorta metal implant CHD
CD 42b* 177,2 128,5 161,0 101,3 137,6
CD 62P* 10,3 17,3 10,8 51,2 13,6
Fibrinogen% 30,9 40,9 40,8 48,7 48,4
monocytes % 22,3 16,8 25,8 42,9 43,5
neutrophils % 15,8 7,6 16,4 24,6 24,0
*median fluorescense intensity (% of maximal response after TRAP-6 stimulation), % of leukocytes with aggregated platelets
Increased platelet-leukocyte binding and fibrinogen binding, increased GMP-140 expression on the platelet surface and decreased GP lb correlates with the amount of mechanical stress. Most significant changes were observed in aorta with metal implant and CHD which indicates high grade of platelet activation. We believe that measurement of thromocyte activation assays offer a powerfull tool to analyze biocompatibility of artificial surfaces in implants.
34. LYMPHOCYTES THAT PASS THE CARDIOPULMONARY BYPASS DURING PAEDIATRIC CARDIAC SURGERY SELECTIVELY ADHERE OR ARE SELECTIVELY ACTIVATED
Schlykow V, Bocsi J*, Hambsch J, Schneider P, Tarnok A
Herzzentrum Leipzig, University Leipzig, *, Semmelweiss University of Medicine 1st Institute of Pathology, Budapest Hungary
Cardiopulmonary bypass (CPB) is used during open heart surgery. Potential side-effects of CPB are symptoms similar to septic shock including capillary leak syndrome and multi organ failure. During CPB the loss of certain types of activated lymphocytes from the peripheral blood (PB) has been described. The aim of our study was to investigate whether components of CPB do bind these cells and if there is a selection by the various parts of CPB (venomedicard, oxygenator, paper filter, fibre). Nine CPB operations in children were studied. PB samples were collected at the beginning and the end of CPB (control). The various parts of CPB were washed and the obtained leukocytes (1-2x109 cells) immunophenotyped by flow cytometry. T-lymphocytes were as frequent as in the PB. However, the proportion of CD25+ (IL-2 receptor) and CD54+ (ICAM-1) T-cells was 1/3 to 1/2 fold lower and that of CD69+ (early activated cells) Tcells 2 to 4 fold higher than in the PB. Proportion of B-cells was 2 to 3 fold higher than in the PB. Among these cells the fraction of CD69+ cells was 2 to 15 fold higher than in PB. Furthermore, we detected a selective binding of Iymphocyte subsets by the various filters of CPB. In the paper filter we saw the highest proportion of CD25+ T-lymphocytes and the lowest frequency of CD69+ Tlymphocytes in comparison to the other filters. B-cells, in contrast, adhered non selectively to all filters of the CPB. As activated cells can release interleukins or other biologically active molecules into the PB we think that their selective binding to components of the CPB could induce a selective stimulation and might therefore contribute to CPB related complications. (This work was supported by the Sächsisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst, SMWK).
35. CHARACTERISATION OF ACTIVATED T- AND B-LYMPHOCYTE SUBSETS DURING CARDIOPULMONARY BYPASS BY FOUR-COLOUR DUAL-LASER FLOW CYTOMETRY.
Attila Tarnok, Jorg Hambsch, *Jozsef Bocsi, Peter Schneider
Paediatric Cardiology, Herzentrum GmbH, University Leipzig, Germany,
*Semmelweis University of Medicine Institute of Pathology, Budapest Hungary
Cardiac surgery with cardiopulmonary bypass (CPB) can induce post-operative capillary leak syndrome (CLS) and multi organ failure. The reason for CPB induced CLS has not been clarified yet. During CPB we have described the loss of activated Iymphocytes from the peripheral blood (PB) (in Faist (ed.): The Immune Consequences of Trauma, Shock and Sepsis. Monduzzi Editore, Italy, 1997, pp129). B-cell counts decreased by >50% due to the loss of 86% of early activated (CD69+) cells. The fraction of activated T-cells (CD69+, CD25+ (IL-2 receptor)) decreased by up to 70% whereas the fraction of CD54+ (ICAM-1) or HLA-DR+ cells did not change significantly. We further characterised the subsets of activated leukocytes using four-colour antibody combinations:
1. CD 19(F ITC)/CD69(PE)/C D3(PerC P)/CD45(APC),
2. CD54(F ITC)/CD25(PE)/C D3(PerCP)/CD 19(APC)
From 12 paediatric patients peripheral blood samples were collected before during and after surgery and analysed on a dual-laser flow cytometer (FACSCalibur). In some patients also Iymphocytes adhering to the CPB were characterised. Our data indicate a dramatic decrease of CD69+ T (50%) and B (65%) lymphocytes but not NK-cells during CPB. T-lymphocytes were mostly CD25+(30%) or CD54+(15%), only a low fraction was CD25+54+ (5%). 50% were CD25-54-. During surgery the percentage of CD3 54+ did not change significantly whereas that of CD3 25 dramatically decreased and recovered only 1 d after surgery. The percentage of CD3 25+54+ remained unchanged until the end of surgery but increased thereafter up to 15%. Concurrently the percentage of CD3 25-54- decreased to 25%. B-lymphocytes were mostly CD54+(50%) or CD25+54+ double positive (15%) and only a low fraction of CD25+ (6%). 28% were double negative. As with the T-cells the percentage of CD19+54+ did not change significantly whereas that of CD19+25+ and CD19+25+54+ decreased during surgery and recovered only 1 d after surgery. In the CPB predominantly CD3+69 and CD19+69 but not CD3+25+ were found. Measurements of apoptotic Iymphocytes with Annexin V and propidium iodide did not yield detectable increase of damaged or apoptotic cells during CPB.
Our data indicate that during paediatric open heart surgery CD3 69+ but not CD3+25 54~ Iymphocytes are selectively filtered by the CPB. We conclude that during surgery cells with CD3 25 54~ phenotype migrate into discrete parts of the organism (homing). Due to their increased ability to produce and secrete cytokines these cells could in part be inducers of local inflammations and postoperative CLS. (Supported by the Sächsisches Ministerium fur Wissenschaft und Kunst).
36. SEPARATION OF MYELOMA PLASMA CELLS FROM PERIPHERAL BLOOD AND BONE MARROW BY MAGNETIC CELL SORTING (MACS).
M. Herber, H. Tesch*, S. Miltenyi, J. Schmitz and M. Assenmacher
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany
* Klinik I für Innere Medizin, Institut für Pathologie der Universität zu Köln, Köln, Germany
Myeloma is a malignancy of plasma cells (PCs). Diagnosis is usually confirmed by detection of monoclonal infiltration of PCs in the bone marrow (BM) and the BrdU-labeling index (Ll) of monoclonal BM-PCs is an important prognostic factor. Also frequency and Ll of monoclonal PCs in peripheral blood (PB) seem to be independent prognostic factors. However analysis of myeloma PCs in PB is often hampered by their low frequency.
We have developed a magnetic separation procedure for plasma cells from peripheral blood and bone marrow using CD138 (Syndecan-1) as PC-specific marker. From peripheral blood of normal donors only few cells could be enriched, which express CD138 weakly. These CD138dim cells expressed CD19, CD38 and CD45, but CD45 less bright than the majority of leucocytes.
Using PBMC spiked with U266 myeloma cells we could demonstrate efficient enrichment as well as depletion of myeloma cells by MACS. In myeloma patients CD138 positive cells could be enriched with high purity and high yield from peripheral blood or bone marrow. !ntraceFlular staining; of !g r -!ight chains showed that GD138 positive cells had a plasma cell morphology and most of them expressed the same light chain indicating that they are of monoclonal origin. CD138+ cells from myeloma patients didnt express CD19.
Our results show that myeloma PCs can be efficiently enriched from PB and BM. Immunomagnetic separation of myeloma cells accordi

=== ENVIROMENTAL ANALYSIS ===


37. DETECTION AND IDENTIFICATION OF MICROBIAL POPULATIONS IN MINERALWATER USING DNA-STAINS, FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION, AND FLUORESCENCE MICROSCOPY OR FLOW CYTOMETRY
Harald Meier and Wolfgang Beisker
GSF-Forschungszentrum Neuherberg, Durchflußytometrie, 85764 Neuherberg
In terms of defining common microbial standards for bottled mineral water within the European Union (EU) the bacterial flora within this habitate has to be examined. Methods were developed for a rapid detection and identification of bacterial cells without previous cultivation. Combining membrane filtration, DNA-staining, fluorescence in situ hybridization, and epifluorescence microscopy the total cell counts and the compositions of bacterial populations were determined within several brands of uncarbonated mineral water. The total cell counts ranged from 1.000 to 100.000 cells/ml depending on the brand. The dominating bacterial populations in bottled uncarbonated mineral water were identified as members of the G-subclass of the Proteobacteria.
As a first stage towards automatized detection, identification and counting of microbial populations the fluorescence intensities of different DNA-dyes were measured in stained mineral water bacteria by flow cytometry. Concentration and staining protocols were optimized. Dyes from the Toto-, ToPro- and YoYo-families were found to be more suitable DNA-stains than conventional dyes for detection and counting of mineral water bacteria. First results to combine DNA-staining with fluorescence in situ hybridization (FISH) usinq rRNA targeted probes are presented.
38. ROUTINE MONITORING OF PHYTOPANKTON BIOMASS BY FLOW CYTOMETRY
A. M. Steinberg, Partec GmbH
The effects of eutrophication of coastal and inland waters lead more and more to the necessity of obtaining an increasing amount of data on phytoplankton abundance, distribution and development. These data provide useful informations to support local or national authorities in the water management of natural or artificial waterbodies. The traditional method to investigate on data of phytoplankton biomass has been that of visual microscopy and spectrophotometric chlorophyll determination. Results of this analysis have been extensively compared with data from flow cytometric measurements of the same samples. Different flow cytometers have been set-up and tested on their properties measuring phytoplankton of various origin ( algae cultures, fresh and sea water) and different trophic levels under laboratory and under field conditions. Long-term surveys of subalpine lakes have been carried out as well as cruises in coastal areas of the Adriatic Sea.
39. DETEKTION VON DINOFLAGELLATEN DURCH AUTOFLUORESZENZ UND IN-SITU-HYBRIDISIERUNG IN KULTUREN UND WASSERPROBEN
Joachim Brenner*, Joachim Hehl*, Nathalie Simon**, Linda Medlin***, Hans-Dieter Görtz*
* Universität Stuttgart, Biologisches Institut, Abteilung Zoologie, Pfaffenwaldring 57, 70550 Stuttgart
** Station Biologique F-29682 Roscoff, Cedex, France
*** Alfred-Wegener Institut fur Polar- und Meeresforschung, Am Handelshafen 12, 27570 Bremerhaven
Dinoflagellaten sind einzellige haploide Algen mit zwei unterschiedlichen Geißeln. Sie gehören zwar zu den Eukaryonten, unterscheiden sich jedoch von diesen in ihrer nuklearen Organisation und in der Form ihrer Mitose erheblich. Sie besitzen keine Histone und ihre Chromosomen bleiben auch während der Interphase kondensiert. Autotrophe Dinoflagellaten besitzen neben Chlorophyll a+c als photosynthetische Pigmente auch 13- Carotin, Xanthophyll und Peridinin als akzessorische Pigmente, die ihnen die typische gelbbraune oder rotbraune Farbe verleihen. Verschiedene marine Dinoflagellaten verursachen weltweit Algenbluten, sogn. 'Red Tides', von denen einige spektakular erscheinen, jedoch nicht toxisch sind, z. B. das durch Noctiluca miliaris verursachte Meeresleuchten. Andere Dinoflagellaten, z. B. Alexandrium tamarense sind fur toxische Algenbluten verantwortlich. Das von ihnen gebildete Neurotoxin Saxitoxin (Na+-Kanal-Blocker) wird von Muscheln angereichert und kann beim Menschen über Lähmungen bis zum Tode führen.
Während zweier Forschungsfahrten zu den Orkney Inseln (Schottland) im August 1996 und Mai/Juni 1997 mit dem Forschungsschiff ,,HEINCKE" (Biologische Anstalt Helgoland), untersuchten wir verschiedene Algenbluten mit einem an Bord installierten Durchflußzytometer (FACS ANALYZER).
Der Dinoflagellat Gymnodinium mikimotoi war fur das Fisch- und Muschelsterben verantwortlich, welches sich während des Zeitraumes der Beprobung im August 1996 bei den Orkney Inseln und an der Westküste vor Schottland ereignete. Gymnodinium mikimotoi konnte nach Anreicherung des Planktons über inverse Filtration von anderen Planktonorganismen anhand seiner photosynthetischen Pigmente eindeutig unterschieden werden. Durch ein Neuronales Netz war es möglich diese Dinoflagellaten anhand ihres Parametermuster in den Proben zu erkennen.
Alexandrium tamarense verursachte im Mai/Juni 1997 eine toxische Algenblüte (Saxitoxin) in demselben Seegebiet. Durch Fluoreszenz- In-Situ-Hybridisierung (FISH) mit einer geeigneten Oligonukleotid-Sonde komplementär zur ssu rRNA konnte Alexandrium tamarense in Wasserproben erkannt und quantifiziert werden. Zellkonzentration und Menge an Saxitoxin in den Wasserproben, gemessen durch HPLC, zeigten in einigen Fällen eine gute Korrelation.
Key Words:
Durchflußzytometrie, Dinoflagellaten, Gymnodinium mikimotoi, Alexandrium tamarense, toxische Algenbluten, inverse Filtration, Fluoreszenz-ln-Situ-Hvbridisierunq (FISH), ssu rRNA
40. FLOW-CYTOMETRISCHE BESTIMMUNG VERSCHIEDENER VITALITÄTSPARAMETER VON RALSTONIA EUTROPHA
Müller, Susann
Universität Leipzig, Sächsisches institut fur Angewandte Biotechnologie (SIAB), Permoserstr. 15, 04318 Leipzig
Ralstonia eutropha ist ein ubiquitär vorkommender, sich chemolithotroph bzw. fakultativ heterotroph ernährender Vertreter von gram-negativen Bakterien der ß-Gruppe, der in der Lage ist, Phenol abzubauen. Er dient in den vorgelegten Untersuchungen als Modellobjekt, indem er Bedingungen ausgesetzt wird, die denen naturlicher Habitate entsprechen.
Schadstoffe abbauende Populationen sind Mischpopulationen, deren Individuen klassen-, subklassen- und speziesspezifisch differenziert werden müssen, will man über ihre Stoffwechselaktivitäten Auskunft erhalten. F¨ur Ralstonia eutropha wurde sowohl eine speziesspezifische als auch eine gruppenspezifische Sonde fur in situ-Hybridisierungs - Experimente eingesetzt.
Zunächst wurden Untersuchungen vorgenommen, die Aussagen zur metabolischen und generativen Vitalität des Stammes bei Einsatz verschiedener C-Quellen ermöglichen.
So konnte der Stamm sowohl auf Acetat (umax von 0,475 h-1) als auch Phenol ( umax von 0,426 h-1) nach einer anfänglich ausgedehnten lag-Phase von bis zu 2 Tagen kultiviert werden. Seine Individuen wurden bezüglich ihrer Proliferationsaktivität (Messung der Änderung des DNS und rRNS Gehaltes) und ihrer Stoffaufnahmekapazität (via Membranpotential) charakterisiert. Die Darstellung der Vitalität der Zellen über ein intaktes Membranpotential ermöglicht Aussagen über den aktuellen energetischen Zustand einer Zelle und geht insofern uber eine Lebend/Tod - Bestimmung hinaus. Die Einzelheiten der Kalibrierung werden vorgestellt.
Zellen, die nicht mehr proliferieren können, sind durchaus in der Lage, Schadstoffe zu assimilieren, jedoch unterscheiden sie sich in ihrer energetischen Situation erheblich von denen, die zur Proliferation in der Lage sind und eben dadurch (Erhöhung der Zellzahl) das Abbaupotential erhöhen. Eine toxische Wirkung des Xenobiotikums ist schon bei Konzentrationen uber 0,03% in einer Batch-Kultivierung zu beobachten. Dieser Wert wird selbst in natürlichen kontaminierten Habitaten elten erreicht. Ralstonia eutropha scheint in seiner Überlebenskapazität innerhalb einer Mischkultur gegenüber Acinetobacter calcoaceticus (s.a. Poster Herrmann et al.) nicht durch seine metabolischen Fähigkeiten an sich, sondern eher durch genetisch vorgegebene Regulationsmechanismen, die die Wachstumsgeschwindigkeit beeinflussen, auch auf idealen Substraten benachteiligt zu sein.

=== NEW METHODS AND APPLICATIONS ===


41. MICROINJECTION OF AN ANTIBODY AGAINST HEAT SHOCK PROTEIN HSP 27 IN CULTURED HUMAN KERATINOCYTES PROTECTS FROM LETHAL UV INJURY.
C. Bayerl, R. Fischer2, M. Trendelenburg2, E. Jung1
1 Department of Dermatology, Mannheim Medical School, University of Heidelberg,68167 Mannheim, 2 German Center of Cancer Research, Biomedical Structure Analysis Group 0190, 69120 Heidelberg
Heat shock protein (HSP) 27 belongs to a family of polypeptides that protect cells against heat, cytokines, mitogens, oxidative injury, and other environmental stress factors, mainly by preventing the aggregation and misfolding of denatured cellular proteins. The possible role of HSP 27 in protecting against UV injury was investigated.
First, HSP 27 immunohistochemical labeling (monoclonal antibody, moAb, to HSP 27, Amersham Buchler, Braunschweig) was performed in normal and UV irradiated skin ex vivo. Subsequently, human keratinocytes in culture, seeded on a microgrid, were injected (micromanipulator/injector Eppendorf, model 5170/5242) with eosin, fluorescein isocyanate (FITC) and phosphate buffered saline (PBS) and their survival (trypan blue, MTT-assay) and colony-forming ability was evaluated. Finally, keratinocytes growing on a microgrid were microinjected with the moAb against HSP 27 and their vitality after UV irradition (solar simulator) was studied after 2h, 24h and 12 days. Fine structural changes were estimated by video enhanced photomicroscopy with differential interference contrast (DIC). Moreover, keratinocytes were subjected to immunohistochemical characterization with the moAb to HSP 27.
In human skin ex vivo and in keratinocytes in vitro, immunohistochemistry revealed the constitutive expression of HSP 27 in the cytoplasm as well as its presence 90 min after UV irradiation in the nucleus. In keratinocytes in culture, puncturing the plasma membrane by nuclear injection with the fluorescent dyes did not result in the reflux of injected material. Microinjection of PBS did not result in any alteration with respect to the morphology in DIC or colony-forming ability of the injected cells. Surprisingly, keratinocytes injected with a moAb to HSP 27 survived UV stress for up to 12 days, while noninjected ones died. DIC of consecutive optical sections revealed no lasting cell injury in injected and additionally UV irradiated keratinocytes that appeared spindle shaped, while noninjected but irradiated keratinocytes were rounded. Additionally, the immunohistochemical labeling of the HSP 27 protein could be blocked by nuclear microinjection of the moAb against HSP 27.
The blocking of HSP 27 by microinjection of a moAb against HSP 27 ensures the survival of keratinocytes after UV irradiation at a UV irradiation dose that would normally be lethal. This protective mechanism remains unclear but characterizes the crucial role of HSP 27 for human keratinocytes in acute UV damage.
42. DIE BESTIMMUNG VON HLA-DR4 MITTELS FLUßZYTOMETRIE IM VERGLEICH ZUM KLASSISCHEN MIKROLYMPHOZYTOTOXISCHEN TEST UND EINER MOLEKULARBIOLOGISCHEN (PCR-SSO) TECHNIK
R. Jilch1, J. Neumüller2 und M. Fischer1
1 Zentrallaboratorium des Krankenhauses der Stadt Wien - Lainz
2 Ludwig Boltzmann Institut fur Rheumatologie und Balneologie, Wien-Oberlaa
Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) weisen eine höhere Frequenz des Histokompatibilitätsantigens HLA-DR4 (50 %) als Kontrollpersonen auf. HLA-DR4 ist allerdings kein Allel, sondern eine s Zweck dieser Studie war es, die Genauigkeit und Verläßlichkeit einer flußzytometrischen Methode (FC) der Firma Medac, Hamburg, zu prüfen. Dieser Test erlaubt die Phänotypisierung von HLA-DR4 sowie der Allele DRB1*0401, DRB1*0404 und des "shared epitopes" durch FlTC-konjugierte monoklonale Antikörper. Zur Diskriminierung von T-Zellen gegenüber Leukozyten wird ein PE-markierter monoklonaler Antikörper gegen CD3 eingesetzt.
Mehr als 200 Typisierungsergebnisse mit dieser Methode wurden mit den Resultaten aus dem mikrolymphozytotoxischen Test (MLCT) verglichen. Dabei wurden f¨ur die Typisierung B-Zellen, die durch Isolation mit magnetischen Beads gewonnen worden waren, verwendet. Im allgemeinen wiesen beide Methoden eine gute Konkordanz auf. In 34 % ergaben sich diskrepante Ergebnisse. Als "goldener Standard" wurde daher ein PCR-SSO-Test (Onli-Test, Fresenius, Bad Homburg) eingesetzt, um eine Entscheidung darüber treffen zu können, welche der beiden Methoden zu falschen Ergebnissen geführt hatte. In der Mehrheit der Fälle waren falsch-negative Ergebnisse durch den MLCT erhalten worden.
Diese Untersuchung hat gezeigt, daß die Typisierung von HLA-DR4 mittels FC eine genaue und verläßliche Methode darstellt. Sie kann sinnvoll eingesetzt werden, wenn ein Hinweis auf die Prognose der RA gewonnen werden soll. Man sollte sich jedoch bewußt sein, daß3 diese Methode auch eine serologische ist, die fehleranfällig im Hinblick auf Kreuzreaktionen und eine schwache Expression des HLA-Moleküls ist. Außerdem gibt sie keinen Aufschluß über andere HLA-Klasse II Antigene, die mit Medikamenten-induzierten Nebenwirkungen bei der Behandlung von RA-Patienten assoziiert sind. Eine solche Untersuchung ist aber vor allem am Beginn einer Therapie nach Erstellunq der Diagnose einer RA von großer Bedeutung.
43. OPTICAL EVALUATION OF THE SYNCRONIZATION IN SMALL GROUPS OF COORDINATED CONTRACTING CELLS DERIVED FROM EMBRYONIC BIRDS.
Götz Pilarczyk, Karl Otto Greulich
Institute for Molecular Biotechnology, Beutenbergstrasse 11, 07745 Jena, Germany, Phone: ++49-3641-656402
The beating frequencies of contracting isles derived from heart muscle are determined by the cell or group of cells with the highest internal frequency (pacemaker). This pacemaker has to create a signal with a certain height to trespass the threshold of the neighboured cells. If the chemical or electrical conductivity between the pacemaker and the following system is decreased by spatial restrictions or the local physiologic state a temporal delay between both is recognizable.
The transient cell culture was provided by excision of the whole hearts from 7-day hatched White-Leghorn eggs, removing the ventricle and encymatic digest of the tissue. After plating the suspension to Petriperm dishes the cells settle down and form aggregates consisting of a few ten to a few hundred cells. After two days in culture these aggregates contract in an coordinated manner indicating that they are coupled chemically as well as electrically.
The cells were loaded with the calcium sensitive dye "Calcium green-1" and imaged in an inverted microscope equipped with an intensified video system. The calcium transients appearing during each contraction could be vizualized. We follow the time course of such a calcium wave s
44. A NEW RELEASE SYSTEM FOR IMMUNOMAGNETIC CAPTURED CELLS.
A. Borgnes, M. Odnakk, A. Kullmann, I. Randen, F. Larsen
BioScience R&D, Dynal A.S, Oslo, Norway
Introduction: Not all cell subsets can be released from Dynabeads by use of DETACHaBEAD (anti idiotypic antibodies). Magnetic beads stuck to the cells can be a disadvantage when the cells are to be studied in other assays such as flowcytometry, growth and cytospin/staining. We have developed a universal release system for mouse antibodies coupled to Dynabeads which gives a high yield of live cells free of beads.
Materials and Methods: Biotinylated antibodies are coupled to Dynabeads via a linker consisting of streptavidin and biotinylated DNA. Crude cell suspension and beads are mixed and by applying a magnet the cells rosetted by beads are selected. Selected cells are washed and DNase specially prepared for cell culture is added to cleave the DNA linker and thereby releasing the cells from the beads. The release system takes only 15 minutes.
Results: Lymphocyte cell subsets from blood: > 95% purity and yield, and > 97 % viability. CD2 cells selected and released were analysed by using flow cytometry;- 99 % were CD45+, 94% were CD3+, 64% were CD4+ and 32 % CD8+. The cells were negative for CD19 and CD15.
Immunomagnetic enrichment of seeded carcinoma cells in PBL and whole blood followed by DNase release: Enriched cells were cultured and did not show altered growthrate compared to unselected carcinoma cells. Cytospins of unreleased and released carcinoma cells were stained. Released cells were easier to detect and could be screened on fewer cytospins.
Conclusion: This enzymatic method for releasing cells from magnetic beads is highly efficient and gentle to the cells providing an excellent yield of pure viable cells.
45. INFLUENCES OF FLUORESCENCE-ACTIVATED (FACS) AND MAGNETIC (MACS) CELL SEPARATION ON CELL PHYSIOLOGY
J. Seidl, F. Hofstädter, L.A. Kunz-Schughart
Institute of Pathology, University of Regensburg, 93042 Regensburg, Germany
Over the past decade cell separation has become an important tool in cell biology and cancer research not only for further direct analysis of defined cell fractions using molecular techniques, flow cytometry etc., but also for 're'-cultivation of pure cell subpopulations.
The aim of our study was to show whether FACS (FACStarPLUS, BD) and/or MACS (Miltenyi Biotec) affect physiology and regrowth kinetics of normal and cancer cells. In particular, we have examined membrane physiology via flow cytometry, determining parameters such as (i) membrane potential using the fluorescence indicator DiBAC3 (4) (Radosevic et a/., J. Immunol. Methods 161:119,1993), (ii) lateral membrane fluidity with a monomer/excimer method utilizing PDA (Galla & Sackman, Biochim. Biophys. Acta 339, 103, 1974), and (iii) membrane asymmetry by measuring the appearance of phosphatidyl-serine in the outer leaflet of the plasma membrane via Annexin-V (Van Engeland et al. Cytometry 24, 131, 1996). In addition, cell viability was recorded using flow cytometric analysis of Pl staining, the trypan blue exclusion technique (TB) and the MTT test, cell volume was measured with the Casy-I System (Schärfe), and monolayer growth curves were documented.
Experiments were carried out on normal, diploid fibroblasts N1 and hyperploid breast carcinoma cells BT474 using the FlTC-conjugated fibroblast-specific antibody AS02 (Dianova) for cell sorting and an additional secondary magnetic-bead-conjugated anti-FITC antibody (Miltenyi Biotec) for MACS. The purity of the resulting positive and negative fractions was remarkably higher after FACS (> 96 %, Normal-RMode) as opposed to MACS (70-94 %) with proportions between 20:80 and 50:50 (N1 :BT474) being tested. Both sorting techniques resulted in a significant reduction in cell viability of both N1 and BT474 cells, with MACS being more 'gentle'. Neither MACS nor FACS modified cell volumes and/or clonogenicity of the viable cells, while preliminary data on cell membrane physiology indicate that membrane potential is enhanced due to cell separation. Since dramatic increase in population doubling time could be shown for normal N1 fibroblasts but not BT474 cancer cells, a causal relationship between membrane potential and regrowth kinetics can be excluded.
(This work was supported by DFG grants Ku 971/2-1 and Ku 971/2-2, Miltenyi Biotec Inc. and Dianova GmbH)
46. HEAD-ACTIVATOR INDUCED MITOSIS OF N15-CA2 CELLS REQUIRES CALCIUM INFLUX AND HYPERPOLARIZATION
Henning Ulrich 1) and Attila Tarnok 2)
Center for Molecular Neurobiology, UKE, D-20246 Hamburg
Present address: 1) Cornell University, Biotechnology Department, Ithaca, NY 14853, USA.
2) Clinics for Pediatric Cardiology, Heart Center Leipzig GmbH, University Hospital, D-04289 Leipzig
In NH15-CA2 cells head activator (HA) stimulates cell proliferation by acting in the G2/M transition. Cells in mitosis were analyzed by flow cytometry 2-4 h after HA application. HA in a dose-dependent manner stimulated mitosis. Mitosis was prevented by preincubation of cells with pertussis toxin identifying the HA receptor as being Gi-protein coupled. As second effect of HA, an increase in intracellular calcium concentration [Ca2+]l was observed. This increase in [Ca2+]l was abolished by inhibiting calcium influx from the extracellular space into NH15-CA2 cells either by chelating extracellular calcium with EGTA or by blocking calcium channels. The increase in [Ca2+]l led to an activation of calcium-dependent potassium channels. The higher potassium conductance resulted in hyperpolarization of NH1 5-CA2 cells. Blocking calcium channels with nickel chloride or potassium channels with tetraethylammonium chloride inhibited the effect of HA on cell proliferation. HA-induced mitosis was inhibited by charybdotoxin and apamin, but not by a-dendrotoxin confirming the notion that Ca2+-dependent potassium channels are involved in mediating the effect of HA on cell division.
47. INFORMATION CONTENT OF CELLULAR AND HUMORAL MEASUREMENTS IN CHILDREN CARDIAC SURGERY AND IN JUVENILE ASTHMA AS EVALUATED BY CLASSIF1 DATA PATTERN ANALYSIS
G.Valet1), A.Tarnok2), J.Hambsch2), J.Handrick3), E.Brautigam3) 1) Max-Planck-lnstitut fur Biochemie, AG Zellbiochemie, Martinsried 2) Pädiatrische Kardiologie, Herzzentrum Leipzig, 3) Pathologisches Institut, Klinikum Görlitz
Biochemical aberrations in cellular systems or organs may cause disease. Such abberrations are e.g. detectable by flow cytometric analysis of cell biochemical parameters in combination with the analysis of humoral body compartments. The obtained information should provide, in theory, significant insight into patient diagnosis and prognosis. An increasing dfficulty concerns, however, the overall interpretation of the multitude of parameters collected in the clinical environment. The goal of the present study concerned the standardized, portable and automated classification of multiparameter data (Valet et al. Cytometry Clin Part 1997 in press, Ann.NY Acad.Sci 677,233-251(1993)) for clinical diagnosis but particulary also of the establishment of individual patient prognosis.
Postoperative Capillary Leak Syndrome (CLS) represents a serious complication in children cardiac surgery. The cause for CLS inducton is not very well known. CLS could be induced by surgery, by a preexisting body condition or by a mixture of both. The CLASSIF1 analysis of a data base with 59 clinical, clinical chemistry and flow cytometric parameters from 9 unaffected and 9 postoperative CLS patients as well as of a data base with 9 intrasurgery parameters revealed that a preexisting biochemical condition, characterized by decrease of C1-inhib, increases of IL10, soluble ICAM1, E-selectin, serum and urine histamine, % and absolute granulocyte counts, permits the correct preoperative identification of children with postoperative CLS. Intrasurgery parameters suggest only a trend (increased operation time, pronounced hypothermia). The data pattern points towards a labent preoperative infection as a possible cause for CLS suceptibility.
The early recognition of asthmatic but in the future also of preasthmatic children constitutes an important challenge for the optimal longterm disease treatment. A data base with 49 clinical chemistry parameters (1) from 24 normal and 50 asthmatic children, 103 relative (%) and absolute cell counts (11) from flow cytometric immunophenotype analysis of CD antigens (CD4/8, CD3/19, CD3/56, CD3/HLA-DR, CD45/14, CD4/29, CD57/8, CD25/3, CD51/9, CD21/19, CD71/3, IgG/lgG control) as well as 1224 data base columns from the exhaustively evaluated list mode data of the measurements (III) were pattern classified. While the data of (I) correctly identified 96.0% of the children, a signification number of double classifications (7%) was obtained. Patient identification by the data of (II) was similar with reduced double classifications (2%) while the exhaustive tlow cytometric list mode data analysis (III) provided 98.7% correct classifications without double classifications (0%). Cellular measurements provided better classfication than clinical chemistry measurements. They also significantly reduced the number of necessary measurernent for data pattern establishment from 12 (I) over 8 (II) to 1 (III).

=== POSTER SESSION ===


48. SCHNELLE ANALYSE UND SORTIERUNG VON CHROMOSOMEN MIT DEM HEIDELBERGER SLIT-SCAN FLUßFLUOROMETER
Klaus Aldinger1, DietmarWolf1, Christian Pister1, Norbert Fischer1, Michael Hausmann1, Christoph Cremer1,2
1 = Institut für Angewandte Physik, Un 2 = Interdisziplinäres Zentrum für Wissenschaftliches Rechnen (IWR), Universität Heidelberg
Die Slit-Scan Flußfluorometrie bietet in Verbindung mit einem schnellen Datenverarbeitungssystem zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten bei der Analyse großer Mengen fluoreszenzgefärbter Chromosomen, die die Einsatzgebiete bisheriger Flußzytometer weit übersteigen. Durch Informationen über die örtliche Farbstoffverteilung auf Chromosomen können morphologische Parameter bestimmt werden. Diese können beispielsweise in der biologischen Dosimetrie zur Erkennung struktureller Aberrationen (dizentrische Chromosomen, Translokationen) herangezogen werden oder bieten spezifische Unterscheidungsmöglichkeiten bei Chromosomen mit ähnlichem DNA-Gehalt. In Verbindung mit der Sortiermöglichkeit beim Heidelberger Slit-Scan kann die Qualität der Analyse durch eine anschließende mikroskopische Untersuchung bestimmt werden.
Beim der Slit-Scan Apparatur passieren - durch die Hydrodynamik längs ausgerichtete - Chromosomen oder andere gefärbte Partikel einen hochfokussierten Laserstrahl in einem freien Flüssigkeitsstrahl mit einer Geschwindigkeit von 10 m/s. Die zeitliche Veränderung des Fluoreszenzlichts wird mit 100 MHz digitalisiert und gibt Aufschluß über die Gestalt der Chromosomen. Hierzu berechnet der Computer die Länge der Chromosomen, ihren DNA-Gehalt (Integral), die Anzahl der Centromere und bei Chromosomen mit einem Centromer ihren Centromerindex (Cl).
Im Hinblick auf künftige Anwendungen ist die Hard- und Software bereits auf drei Eingangskanäle ausgelegt. Aus den Signalen auf dem zweiten und dritten Kanal wird jeweils innerhalb des Chromosomenbereichs, der aus dem Signal des ersten Eingangs bestimmt wurde, der DNA-Gehalt berechnet. Diese beiden Kanäle dienen zur Erkennung zweier weiterer DNA- spezifischer Marker, die durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung angebracht wurden.
Zwischen dem Zeitpunkt der Detektion eines Chromosoms und dem Aussortieren dürfen wegen der Eigenschaften des vorhandenen Flußsystems maximal 500 us vergehen. In dieser Zeit muß die Analyse eines Chromosoms in allen drei Eingangskanälen abgeschlossen sein, um einen Sortier- Entscheid zu treffen. Um dies zu ermöglichen, wird ein Zwei-Prozessor Rechner auf VMEbus Basis eingesetzt. Die beiden eng gekoppelten Prozessoren haben dabei unterschiedliche Aufgaben: CPU 1 ist zuständig für die grafische Ausgabe der Meßdaten, deren Speicherung, Bedienung des Programms und ermöglicht eine nachträgliche Analyse der Meßdaten. Die Echtzeit-Analyse der Chromosomen findet auf CPU 2 statt. Dieser Prozessor wird ohne Betriebssystem betrieben, wodurch dessen Rechenzeit für ein einziges Programm zu 100 % zur Verfügung steht. Die Analysezeit pro Chromosom beträgt maximal 430 us, weitere 170 us werden dazu benutzt, Initialisierungen vorzunehmen und die berechneten Parameter für CPU 1 aufzubereiten. Dadurch ist es möglich, ca. 1600 Chromosomen/s zu analysieren, bzw. zu sortieren.
49. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE BESTIMMUNG VON DINOFLAGELLATEN (Gymnodinium mikimotol) IN TOXISCHEN ALGENBLÜTEN
Joachim Brenner*, Gunnar Gerdts**, Erik Hagmeier**, Sylke Lutz*, Christian Schütt**, Hans-Dieter Görtz*
* Universität Stuttgart, Biologisches Institut, Abteilung Zoologie, Pfaffenwaldring 57, 70550 Stuttgart
** Biologische Anstalt Helgoland, Meeresstation, Abteilung Meeresmikrobiologie, 27483 Helgoland
Während der Forschungsfahrt zu den Orkney Inseln im August 1996 mit dem Forschungsschiff "HEINCKE" (Biologische Anstalt Helgoland), testeten wir eine inverse Filtrationseinheit zur Anreicherung von Planktonorganismen, insbesondere von Dinoflagellaten, in einem Größenbereich von 10 -100 um. Die Detektion, Charakterisierung und Zellzahlbestimmung der Dinoflagellaten erfolgte mit einem an Bord installierten Durchfluß- zytometer (FACS ANALYZER). Die Wasserproben wurden meist aus 1 m Wassertiefe entnommen und über eine zweistufige inverse Filtration um den Faktor 1000 angereichert. Diese Anreicherung war für mikroskopische und durchflußzytometrische Bestimmungen der Dinoflagellaten ausreichend. Die toxische Algenblüte bei den Orkney Inseln wurde uberwiegend durch Gymnodinium mikimotoi verursacht. Dieser Dinoflagellat war für das Fisch- und Muschelsterben verantwortlich, welches sich während des Zeitraumes der Beprobung bei den Orkney Inseln und an der Westküste vor Schottland ereignete.
Gymnodinium mikimotoi ist als ungepanzerter Dinoflagellat sehr fragil und zudem nur schwierig eindeutig zu bestimmen. Fixative, wie Lugolsche- Lösung und Glutaraldehyd, sowie die bloße Beobachtung der Zellen unter dem Mikroskop führen zu einer schnellen Deformation der Zellen und zu einer Veränderung ihrer Morphologie. Die Technik der inversen Filtration erwies sich als eine sehr schonende Methode zur Anreicherung von Zellen des Planktons. Mit Hilfe der Durchflußzytometrie konnten wir in allen Wasserproben und zusätzlichen Wasserproben aus unterschiedlichen Tiefen G. mikimotoi eindeutig detektieren. Durchflußzytometrische Dot-Plots zeigten G. mikimotoi immer als eine distinkte Population, die von anderen Planktonorganismen deutlich unterschieden werden konnte. Neben den durchflußzytometrischen Ergebnissen, wurden nach der Fahrt auch quantitative, mikroskopische Zählungen nach Utermohl durchgeführt. Diese bestätigten den hohen Anteil von G. mikimotoi in den Proben. Ueberdies konnten wir die allmählichen morphologischen Veränderungen von G. mikimotoi mit dem Durchflußzytometer verfolgen. Durch den Vergleich von durchflußzytometrischen Messungen und mikroskopischen Zählungen wird bei zukünftigen Forschungsfahrten eine Quantifizierung einzelner Spezies möglich sein. Die Durchflußzytometrie erlaubt somit im Zusammenhang mit der inversen Filtration ein schnelles Monitoring einzelner Spezies des Phytoplanktons und kann somit zur Ueberwachung von toxischen Algenblüten eingesetzt werden.
Key Words: Gymnodinium mikimotoi, toxische Algenblüten, inverse Filtration, Durchflußzytometrie, Utermohl-Technik
50. EFFECT OF INTERSTITIAL RADIATION (IR) AND/OR LOCAL TUMOR HYPERTHERMIA (LTH) ON CELL-CYCLE PROGRESSION IN THE DUNNING R3327 PROSTATE TUMOR MODEL
V. Ehemann1, P. Peschke2, A. Lange1, H.F. Otto1
1)Institut of Pathology, University of Heidelberg, 2)German Cancer Reasearch Center, Heidelberg
purpose:The impact of continous low dose rate interstitial radiation (IR) and/or local tumor hyperthermia (LTH) on the cell cycle progession and the proliferation index was evaluated in the Dunning R3327 prostate tumor model in vivo.
Material and methods: IR was carried out by the insertion of one 192-lr seed into the center of a tumor. LTH treatments (43°C for 30min, H20 bath=43,5°C) were applied just before the start of IR. Tumor specimen were obtainted at selected time points after single or combined treatment. Tissues were prepared according to the method of F.J. OTTO. DNA-content was meassured by a PAS II flow cytometer (Partec). Histograms were analysed using the Multicycleprogram (Phoenix).
Results: Hyperthermia induced only a minor reduction in the S-phase fraction and a slightly higher amount of cells in G2/M-phase. After IR alone the lowest number of cells in S-phase were found at 72hrs post treatment. In addition, during the course of brachytherapy the amount of cells in G2/M phase increased from 17% in control animals up to 45% at 72hrs. Apoptotic cell populations could be detected after 24hrs respective 48hrs after the combined treatment with heat and irradiation. The ratio of diploid vs. aneuploid cells showed an dramatic effect after 72hrs.
Conclusion: Interstitial radiation (IR) combined with hyperthermia is a very effective treatment modality in the thermoresistant Dunning tumor subline R3327-AT1 as revealed by flow cytometric analysis in vivo. The effectiveness of thermoradiotherapy at low dose rates might be influenced by cell cycle redistributrion.
51. NACHWEIS VON ZYTOKERATINPOSITIVEN ZELLEN IM KNOCHENMARK UND IM PERIPHEREN BLUT BEI PATIENTEN MIT MAMMAKARZINOM ODER KOLONKARZINOM.
Grotius O., Doll S., Braun P., Habets L. und Knechten H.
PZB Aachen, Blondelstraße 9, 52062 Aachen
In den letzten Jahren festigte sich der Standpunkt, daß okkulte Mikrometastasen, die im Knochenmark nachweisbar sind, einen prognostisch wichtigen Parameter darstellen. Verfahren, die eine sensitive Detektierung und Quantifizierung dieser Zellen ermöglichen, haben einen hohen klinischen Stellenwert für ein verbessertes Tumorstaging.
Intrazelluläres Zytokeratin 8/18 ist ein spezifischer Marker für Zellen epithelialen Ursprungs und für epitheliale Zellen.
Mit einer immunomagnetischen Anreicherung (MACS / Magnetic Activated Cell Sorting) ist es möglich, Zytokeratin 8/18 positive Zellen in nicht epithelialem Gewebe, wie dem peripherem Blut oder dem Knochenmark, um bis zu vier Zehnerpotenzen aufzukonzentrieren. Dieses Verfahren bietet mit einem anschließenden durchflußzytometrischen Nachweis die Möglich- keit, wenige Zytokeratin 8/18 positive Zellen in bis zu 108 Leukozyten nachzuweisen.
Im Rahmen unserer Pilotstudie wurde gezeigt, daß bei Tumorpatienten ein Nachweis der Zytokeratin 8/18 positiven Zellen mittels der Kombination MACS/Durchflußzytometrie mit einer Signifikanz von 1 Tumorzelle auf 10 Million Leukozyten möglich ist.
Untersucht wurde das Knochenmark von 11 weiblichen Patienten mit Mammakarzinomen und 4 männlichen Patienten mit Kolonkarzinomen. Zusätzlich wurde bei 7 der oben erwähnten Patienten das periphere Blut auf Zytokeratin 8/18 positive Zellen untersucht.
Für die Untersuchung wurden bei jedem Patienten 10,5 ml Knochenmark entnommen. Nach der Biopsie wurde das heparinisierte und in Medium aufgenommene Knochenmark innerhalb von 24 Stunden verarbeitet.
Zur Leukozytenanreicherung wurden 4 ml des Knochenmarks zentrifugiert (Buffy Coat). Nach der magnetischen Markierung und Anreicherung der Zytokeratin 8/18 positiven Zellen, wurden die Zellen fluoreszenzmarkiert (CD45-FITC/ Ck8-18-PE) und durchflußzytometrisch unter Cellquest im FACScan gemessen.
Im Knochenmark wurden bei 14 von 15 Patienten Zytokeratin 8/18 positive /CD45negative Zellen nach einer Anreicherung detektiert. Die untersuchte Zellzahl lag zwischen 15x106- 116X106 Leukozyten. Die Anzahl der gefundenen Zytokeratin 8/18 positiven Zellen variierte von 1 bis ca. 190.000 und lag in einem Konzentrationsbereich von 1:78 - 1 :89x106.
In 5 von 7 Fällen wurden im peripheren Blut Zytokeratin 8/18 positive Zellen nachgewiesen. In Analogie zum Knochenmark lag die Leukozytenzahl zwischen 19x106-77x106. Die Zytokeratin 8/18 positiven Zellen traten im peripheren Blut in einer geringeren Frequenz als im Knochenmark auf und reichten von 2 - 21 Zellen, die in Konzentrationen von 1:707 bis 1:28X106 vorkamen.
Bei allen Patienten, die sich in einem fortgeschrittenem Stadium befanden, wurde eine hohe Anzahl Zytokeratin 8/18 positiver Zellen sowohl im Knochenmark, als auch im peripheren Blut festgestellt. Es konnte gezeigt werden, daB der Einsatz der Anreicherung (MACS) in Kombination mit der Durchflußzytometrie eine Nachweisgrenze von 1:107 erreicht und große Zellmengen unproblematisch untersuchbar sind.
52. INDUCTION VON APOPTOSE DURCH 2-CYCLOHEXEN-1-ON BEI VIER HUMANEN LEUKÄMIEZELLINIEN, SOWIE NORMALEN BLUTLYMPHOZYTEN
A.Genzlinger1, K. Romanakis1, C. Janzowski2, H. Zankl1,
1 Abt Humanbiologie und Humangenetik, 2 Abt. Lebensmittelchemie und Umwelttoxikologie, Universität Kaiserslautern
Aromawirksame a, ,ß-ungesättigte Aldehyde und Ketone sind in der Natur als Inhaltsstoffe zahlreicher Obst - und Gemüsepflanzen weit verbreitet und kommen in einer Vielzahl von Lebensmitteln vor. In cyclamathaltigen Erfrischungsgetränken wurde 2-Cyclohexen-1-on in Konzentrationen bis etwa 15uM nachgewiesen. Bei verschiedenen Untersuchungen hat sich Cyclohexenon in V79 Zellen als potentes cytotoxisches Agens mit einem IC50-Wert von 18uM (24h Inkubation und 3d Post Inkubation) erwiesen.
In der vorliegenden Untersuchung wurde das Potential von 2-Cyclohexen-1-on zur Induktion von Apoptose an den Zellinien U937, HL-60, K562 und Molt4, sowie an Ficoll isolierten Blutlymphozyten (8 Probanden) getestet. Die eingesetzten Konzentrationen lagen zwischen 10 und 100uM bei den Zellinien, bei den Blutlymphozyten bis 150uM (bis 24h). Die auftretende Apoptose wurde mikroskopisch nach morphologischen Kriterien (DNA-Kondensation, Fragmentierung des Zellkerns, apoptotische Bodies), sowie durchfluß- zytometrisch durch Bestimmung des Sub-G1-Peaks und mit Hilfe einer DNA- Gelelektrophorese (DNA-Leiterbildung) beurteilt und quantifiziert. Mittels Trypanblaufärbung war keine cytotoxische Wirkung in den eingesetzten Konzentrationsbereichen festzustellen. Nach 24-stündiger Inkubation wurde durchflußzytometrisch ein dosisabhängiger Anstieg (bei U937 und K562 ab 25uM, bei HL-60 ab 50uM) des Sub-G1-Peaks beobachtet. Eine Zeitkinetik der maximal induzierten Apoptose (U937: 25%; HL-60: 20%; K562: 28%) zeigte einen kontinuierlichen Anstieg bis 24 Stunden. Bei der Zellinie Molt4 konnte durchflußzytometrisch keine Apoptose nachgewiesen werden. Humane Lymphozyten zeigten im Gegensatz zu den Zellinien schon in der Kontrolle einen deutlichen Sub-G1-Peak, welcher jedoch keinen dosisabhängigen Anstieg aufwies, wobei jedoch große individuelle Unterschiede bei den einzelnen Probanden auftraten. Die mikroskopische Auswertung ergab bei den Zellinien U937 und HL-60 eine gute Korrelation zur Durchflußzytometrie, wahrend dies bei K562 und Molt4 nicht der Fall war.
Die zusätzlich durchgeführte Zellzyklusanalyse ergab, daß Apoptose vorrangig in der S-Phase induziert wurde. Auffällig war außerdem der dosis- und zeitabhängige Anstieg der mitotischen Zellpopulation (U937 und HL-60 auf ca.10%, K562 und Molt4 auf 25 - 30%). Bei der DNA-Gelelektrophorese konnte nur für die Zellinie U937 eine typische DNA-Leiter nachgewiesen werden.
Diese Ergebnisse zeigen, daß 2-Cyclohexen-1-on in der Lage ist, in 3 der 4 getesteten Zellinien Apoptose zu induzieren. Wirksame Konzentrationen liegen deutlich höher als die in Erfrischungsgetränken beobachteten. Die Substanz wirkt dabei präferentiell auf S-Phase Zellen und ruft einen mitotischen Arrest hervor. Zur weiteren Einschätzung des apoptoseinduzierenden Potentials steht ein direkter Vergleich mit seinem offenkettigen Aldehyd (Hexenal) noch aus.
53. HOW THICK IS YOUR SECTION? - A SIMPLE METHOD TO EVALUATE THE SECTION THICKNESS OF PARAFFIN SECTIONS
Gschwendtner A., Lorenz M., Mairinger T.
Dpt.Pathology, University of Innsbruck, Innsbruck, AUSTRIA
The exact measurement of the thickness of paraffin sections used for any kind of quantitative analysis (e.g. DNA - cytometry, IHC-staining - quantification, stereological methods) is important to get reliable results. Although section thickness can be measured with great precision and accuracy using confocal laser microscopy, such instruments are expensive and not easily available to many laboratories. This paper describes a simple method to quantify the section thickness of the rountinely processed paraffin section actually used for image analysis.
To achieve this goal the given section is divided into two parts, the bigger one is used for quantitation whereas the smaller one is re-embedded and resectioned through its thickness. The thickness of the re-embedded section can now easily be measured with any kind of length measurement device avaliable in light microscopy.
54. DNA-MEASUREMENTS ON HISTOLOGICAL SLIDES - DOES IT WORK ON HUMAN TISSUE?
Gschwendtner A., Mairinger T.
Dpt.of Pathology, University of Innsbruck, Innsbruck, AUSTRIA
Introduction: The mathematical correction of DNA-histograms obtained by measurements on thin slides showed promising results when applied on rat liver tissue. The correction of histograms obtained by measurements of sections of human tumour tissue is discussed controversially. The aim of the study was to evaluate the reliability of this approach for different kinds of human tissue.
Material and Methods: Histological sections of different epithelial and non-epithelial types of non-tumorous human tissue were used. The actual section thickness was evaluated accurately. The DNA was measured on these sections with an image analyser. Knowing the actual section thickness correction algorithms were applied to the slab fragments in order to recalculate for the genuine DNA-content of the whole nuclei. The corrected histograms were compared to those of desintegrated whole nuclei of the same tissue block.
Results: The ploidy-equivalents obtained by mathematically correcting DNA-histograms showed fairly good correlation to the ploidy-values of the desintegrated materials. The precision of the measurements depend on the orientation of the nuclei within the histological structures.
Conclusion: Using mathematical algorithms for correcting DNA-histograms seems to be a promising approach to enhance the performance of DNA-measurements on histological slides. This is not only possible for a cell model but for non-tumorous human tissue as well. This opens the way for further investigations on human tumours.
55. TISSUE SECTION IMAGE ANALYSIS OF BREAST NEOPLASMS: THE EXACT SECTION THICKNESS IS THE CLUE TO CORRECT HISTOGRAM RECALCULATION
GSCHWENDTNER Andreas MD, MAIRINGER Thomas MD
Dpt. of Pathology, University of Innsbruck, Innsbruck,Austria
Aim of the study: Mathemathical correction of DNA-histograms obtained by DNA-measurements on thin sections rendered accurate resutis when applied on rat liver tissue and non-malignant human tissues if the exact section thickness of the slide under investigation is known.The aim of the study is to evaluate the potential of theses mathematical correction methods when applied to breast carcinomas.
Materials and Methods: 18 breast carcinomas (7 tetraploid, 6 aneuploid, 5 diploid) were investigated. Thin histological sections as well as single cell praparations were made from the same tissue blocks and stained according to Feulgen. The thickness of the sections investigated was accurately determined for each section. At least 200 tumor cells and about 20 control cells out of benign surrounding tissue were measured on the histological sections by Static DNA Cytometry. Mathematical correction of the histograms was performed using the algorithms of McCready and Haroske. These algorithms proved to render reliable results when applied to other tissues. The histograms of the single cell preparations were used for comparison. Interpretation was performed according to classifications of Auer as well as Boecking.
Results: All diploid tumors remained diploid after histogram correction. The same was true for all aneuploid tumors. 72% of the teraploid tumors showed a distinct tetraploid peak after correction, wereas 28% did not show a second peak and were classified diploid. It was easier to apply Auer classification on the corrected histograms.
Discussion: The mathematical correction of DNA-histograms obtained by DNA-measurements on thin sections rendered excellent results on diploid and aneuploid tumors. in 2 of the tertaploid cases the second peak was not present any more. This may very porbably be due to loss of the tertaploid population present in the single cell population. In these cases the most polymorphic tumor population could not be identified any more compared the original H&E stained slide due to loss of tissue because of the repeated cutting of these paraffin blocks. In our series there was no evidence of false aneuploidy.
Conclusions: When the actual section thickness is known, mathematical histogram correction of measurements performed on histological sections of breast carcinomas using the algorithms of McCready and Haroske render reliable results.
56. FLOW CYTOMETRY MIT REIN- UND MISCHKULTUREN AUS ACINETOBACTER CALCOACATIUS 69-V UND RALSTONIA EUTRPHA JMP134 BEIM PHENOLABBAU
C. Herrmann, U. Kunze1, A. Lösche2, S. Müller2, T. Bley1, W. Babel
Sektion Umweltmikrobiologie, Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbH, Permosestr. 15 04318 Leipzig.
1 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik, TU Dresden, 01062 Dresden.
2 Sächsisches Institut für Angewandte Biotechnologie (SIAB) an der Universität Leipzig, Permoserstr. 15, 04318 Leipzig.
In Batch- und kontinuierlichen Kultivierungen wurde die Wachstumsdynamik von Acinetobacter calcoaceticus 69-V und Ralstonia eutropha JMP134 mit dem Substrat Phenol aufgenommen. Im Chemostat wurde die transient state Methode angewandt, bei der mit sukzessiver Erhöhung der Durchflußrate in kleinen Intervallen quasi stationäre Zustände erreicht werden. Zu jedem dieser quasi stationären Zustände wurden der DNA- und rRNA-Gehalt flowcytometrisch bestimmt. Die DNA wurde mit DAPI gefärbt, für die in situ-Hybridisierungsexperimente (rRNA) wurden fluoreszenz- markierte Oligonukleotidsonden verwendet. Für beide Stämme zeigt sich eine lineare Korrelation von rRNA-Gehalt und spezifischer Wachstumsrate in einem Bereich von 0,1 h-1 bis 0,4 h-1. Bei Ralstonia eutropha JMP134 wurde diese lineare Korrelation durch einen Wechsel im Abbauweg für Phenol (Ortho- und Meta-Weg) unterbrochen. Bei Experimenten mit einer Mischkultur aus beiden Bakterienstämmen zeigt sich bei einer Durchflußrate von D = 0,1 h-1, daß der Stamm Ralstonia eutropha JMP134 aus dem System ausgetragen und vom Acinetobacter calcoaceticus 69-V als Substratkonkurrent verdrängt wird.
57. ZUM STELLENWERT DES PROLIFERATIONSANTIKOERPERS MIB-1 IM VERGLEICH ZU DURCHFLUßZYTOMETRISCHEN PARAMETERN BEI MUNDHOEHLEN- UND OROPHARYNXKARZINOMEN
Christof Hofele, Miriam Seibel, Tilo Barth, Joachim Zöller
Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie der Universität Heidelberg, INF400, D-69120Heidelberg, Germany
Untersucht wurden 50 Fälle von Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx hinsichtlich des Stellenwertes und der Bedeutung des proliferationsassoziierten Antikörpers MIB-1 im Vergleich zu den Werten der durchflußzytometrischen Analyse und des histopathologischen Gradings.
Es zeigte sich, daß mit zunehmendem Malignitätsgrad der Plattenepithelkarzinome das Ausmaß der Expression des Proliferationsantikörpers MIB-1 anstieg. Wenig differenzierte Karzinome zeigten einen signifikant höheren Anteil MIB-1 positiver Zellen als mäßig oder schlecht differenzierte Karzinome.
Im Rahmen der weiteren Untersuchung konnte keine signifikante Korrelation zwischen den MIB-1 Werten und den Werten und den Werten der Durchfluß zytometrie in der G2/M-, der G1- und der S-Phase beobachtet werden. Ebenso konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen histopathologischem Grading und dem S-Phase-Gehalt der Durchflußzytometrie identifiziert werden. Weitere Untersuchungen bezüglich der Korrelation der Expression von Proliferationsantikörpern und den Werten der durchfluß zytometrischen Analyse sind vorgesehen.
58.CIRCADIANE VERÄNDERUNGEN VON ZELL-ZELL-INTERAKTION UND HOMING VON LYMPHOZYTENSUBPOPULATIONEN SOWIE VON HORMONSPIEGELN IM MENSCHLICHEN BLUT
T.O. Kleine, M.K. Eisenacher, K. Ehlenz* und P. Zöfel**
Med. Zentrum für Nervenheilkunde, Funktionsbereich Neurochemie; *Zentrum für Innere Medizin; **Fachbereich Mathematik; Universität Marburg, Germany.
Vorhaben:Signifikante Veränderungen von T Zellen (CD3+) und ihren Subpopulationen, von B Zellen(CD19+) und von NK Zellen (CD16+56+3-) wurden im venösen Blut des Menschen mittels Cosinor-Rhythmometrie aufgezeigt. Hier werden Zell-Zell-lnteraktion (CD11a+ Expression) und Homing-Rezeptor-Kapazität (CD44+ Expression) dieser Leukozyten untersucht im Hinblick auf ihre endokrine Umgebung im Blut.
Methoden:Venöses EDTA-Blut wurde von drei gesunden Männern mit normalen Schlaf-Wach-Rhythmus im 4 h Intervall uber 2 Tage gewonnen. Die Leukozytendifferenzierung und die Analyse von Lymphozytensub populationen wurde mittels FACScan Flow Cytometer mit monoklonalen Antikörper-Reagenzien durchgeführt (Becton Dickinson). Hormonspiegel wurden mittels ELISAs bzw. RlAs analysiert.
Ergebnisse:Mittels Cosinor-Rhythmometrie wurden signifikante Variationen mit Peak-Zeiten gefunden für CD3+ T Zellen und ihre Subpopulationen (Peak-Zeiten zwischen 13.00 und 15.00 h), für CD19+ (16.00 und 19.00 h) und NK Zellen (13.00 und 14.00 h) sowie für Plasma-Spiegel von Cortisol mit Peak-Zeiten zwischen 06.00 und 09.00 h, Testosteron (07.00 und 08.00 h), Prolactin (00.00 und 03.00 h) und Wachstumshormon (hGH) (02.00 und 04.00). Bei der CD11a+ und CD44+ Expression unterschied sich die Peak-Zeit einer CD3+44+ / CD3+44- Subpopulation von derjenigen von CD3+, aber nicht von denjenigen der CD3+11 a+/Subpopulationen. Die Peak-Zeit einer CD19+11 a+/- Subpopulation unterschied sich von derjenigen von CD19+, aber nicht von denjenigen der CD19+44+/Subpopulationen. Eine Peak-Zeit der NK Zellsubpopuiationen CD44+/- oder CD11 a+/- unterschied sich von derjenigen der NK Zellen im venösen Blut. Folgerungen: Unsere Ergebnisse zeigen verschiedene Routen der Zell-Zell-lnteraktion und des Homing-Verhaltens peripherer Lymphozyten des zellulären Immunsystems des Menschen an. Diese Routen dürften durch die Plasmaspiegel von Cortisol, Testosteron, Prolactin oder Wachstumshormon beeinflußt bzw. moduliert werden.
59. VERANDERTE CIRCADIANE MUSTER VON LYMPHOZYTEN SUBPOPULATIONEN UND IHRER ZELLULÄREN INTERAKTION NACH TOTALEM SCHLAFENTZUG IM MENSCHLICHEN BLUT
T.O. Kleine, W. Schreiber* Med. Zentrum für Nervenheilkunde, Funktionsbereich Neurochemie und *Psychiatrische Klinik, Universität Marburg, Germany.
Vorhaben: Cosinor-Rhythmometrie demonstrierte signifikante circadiane Veränderungen von T (CD3+), B (CD19+) und NK Zellen (CD16+56+3-) im peripheren venösen Blut des Menschen. Hier wird der Einfluß von totalem Schlafentzug auf diese circadianen Veränderungen im Blut im Hinblick auf ihre Zell-Zell-lnteraktion (CD11 a+ Expression) und Homing Rezeptor Kapazität (CD44+ Expression) untersucht, um mögliche Regelmechanismen zu finden.
Methoden: Im peripheren venösen Blut wurden Leukozytendifferenzierung und Analyse von Lymphocytensubpopulationen mittels FACScan Flow Zytometrie nach Lyse mit monoklonalen Antikörper-Reagenzien (Becton Dickinson) durchgeführt. EDTA-Blut wurde von vier gesunden Männern wah
60. DIE EINZELZELL-GELELEKTROPHORESE (Comet-Assay) IN SCHLEIMHAUTABSTRICHEN DER WANGE
H. Krüger, A. Kübler, P. Tomakidi, C. Höfele
Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, Im Neuenheimer Feld 400, 69120 Heidelberg
Der Mehrstufenprozeß der Carcinogenese beruht auf genetischen Veränderungen, die sich auch histologisch in verschiedenen Uebergangsstufen äußern können. Veränderungen an der DNS wie beispielsweise Strangbrüche, können bei Nichtreparatur zu Prämutationen führen und lassen sich mit Hilfe des Comet-Assay nachweisen. Ziel der Untersuchungen war es, inwiefern sich dieser Test zur Prognostik bei Krebs-Risikopersonen eignet. Unsere Ergebnisse zeigen, daß DNS in Raucher-Lymphocyten bereits stärker vorgeschädigt ist und mehr Strangbrüche aufweist als in Nichtrauchern. In den Schleimhautzellen ist unabhängig vom Raucherstatus (starke und schwache Raucher bzw. Nichtraucher) eine hohe Zahl von Strangbrüchen feststellbar. Diese ist jedoch deutlichen Schwankungen unterwor
61. DETECTION OF TRIPLOID INDIVIDUALS IN POECILIA FORMOSA - AN NON- INVASIVE METHOD FOR POPULATION SCREENING
Lamatsch DKª, Steinlein C*, Schmid M*, Schartl Mª
ªLehrstuhl für Physiologische Chemie I und *Institut für Humangenetik am Biozentrum der Universitat Würzburg
62. UNTERSUCHUNG VON ZELLULÄREN UND HUMORALEN IMMUNREAKTIONEN IM LUMBALLIQUOR VON PATIENTEN MIT OPTICUS NEURITIS (ON) UND MULTIPLER SKLEROSE (MS)
R. Lehmitz 1, T.O. Kleine 2
1 Zentrum für Nervenheilkunde, Klinik für Neurologie und Poliklinik, Zentrallabor für Liquordiagnostik, Universität Rostock; 2 Zentrum für Nervenheilkunde, Funktionsbereich Neurochemie, Universität Marburg.
Vorhaben: Die Krankheitsbilder Multiple Sklerose (MS) und Opticus Neuritis (ON) weisen beide chronische Entzündungsreaktionen im Lumballiquor auf, die mit unterschiedlichen klinischen und bildgebenden Befunden einhergehen. Hier soll versucht werden, ON und MS mit Hilfe von zytologischen, immunzytologischen und klinisch- chemischen Untersuchungen voneinander abzugrenzen.
Methoden: Die diagnostische Sensitivität von 11 zellulären und humoralen Entzündungsparametern werden bei 24 Patienten mit ON und 36 bis 46 Patienten mit MS mit folgenden Methoden untersucht: Manuelle und Differential-Zellzählung (VK: <35%) und Immunzytochemie von Leukozyten; immunnephelometrische und ELISA Techniken (CV: <15%) zur Berechnung von Albumin-(alb) und Immunglobulin-(lg) Liquor/Serum-Konzentrationsquotienten (Q) bzw. von Antikörperspezifischem Index (Al) für Masern (M), Röteln (R), Varizella Zoster (Z), um hiermit eine lokale Ig-Production oder lokale MRZ-Reaktion (Al > 1.4 nach Reiber) zu ermitteln; isoelektrische Fokussierung mit Immunfixation zur Detektion oligoklonaler Banden (OB).
Ergebnisse: Positive Ergebnisse werden als % der ON-Fälle bzw. als % der MS-Fälle angegeben: Leukozytenzahl >4 M/l: 58%, 57%; Plasmazellen: 71 %, 74%; B Lymphozyten aktiviert für IgM: 38%, 44%; für IgG: 75%, 85%; für IgA: 38%, 56%; Qalb >7: 12%, 20%; lokale Ig-Produktion: IgM: 21%, 17%; IgG: 46%, 65%; IgA: 13%, 11%; IgG-OB: 71%, 100%; MRZ Reaktion (Al > 1.4): 63%, 87%.
Folgerung: Die hier untersuchten Parameter erscheinen zur Unterscheidung zwischen ON und MS ungeeignet; obgleich einige pathologische Werte häufiger bei MS gefunden wurden und IgG-OB in allen Fällen von MS. Darüberhinaus weisen unsere Ergebnisse auf Beziehungen zwischen den Pathomechanismen der MS und solchen bei den meisten ON-Fällen hin. Allerdings wurden bei einigen klinisch gesicherten ON Fällen keine Entzündungszeichen im Lumballiquor gefunden, was verschiedenartige Pathomechanismen oder ON-Untertypen anzeigt.
63. BEITRAG ZUR ZYTOLOGISCHEN UND IMMUNZYTOLOGISCHEN ANALYTIK DES LIQUOR CEREBROSPINALIS
R. Lehmitz 1, T.O. Kleine 2
1 Zentrum für Nervenheilkunde, Klinik für Neurologie und Poliklinik, Zentrallabor für Liquordiagnostik, Universität Rostock; 2 Zentrum für Nervenheilkunde, Funktionsbereich Neurochemie, Universität Marburg.
Vorhaben: Um vergleichbare und optimale Ergebnisse in der Liquor-Zelldiagnostik zu erhalten, sollten Präanalytik und Analytik der Liquorzellanalyse umfassender standardisiert werden.
Angewendete Techniken: Die Standardbedingungen für die Zytozentrifugation mit der HETTICH-Zytozentrifuge werden dargestellt: Gewinnung von zellfreiem Überstand durch Anreicherung der Liquorzellen; Aufnahme des Zellkonzentrates in Albumin-haltigem Medium und Aliquottierung für mehrere Zytozentrifugenpräparate. Die HETTICH-Zytozentrifugen- Technik wird mit der noch gebräuchlichen Sedimentkammer-Technik (mit unkontrolliertem Verlust von Liquorzellen und -flüssigkeit) verglichen. Die Beschichtung der Objektträger mit Polykationen bringt eine verbesserte Zellausbeute besonders für zellarme Liquorproben bei beiden Techniken. Es wird ein einfacher Test zur Wirksamkeits überprüfung von selbst-beschichteten Objektträgern durch Beschickung mit Erythrozytensuspensionen vorgestellt. In der immunzytochemischen Analytik von Liquorzellen hat sich die Färbevorrichtung "Immunette" (ProMedeus Immuntechnologie) für Zytozentrifugenpräparate auf Polykationen-beschichteten Objektträgern bewahrt. Sie erlaubt eine standardisierte Handhabung mit geringen Zellverlusten.
Erqebnisse: Es werden Darstellungen (Standardfärbungen, Immunzytochemie) von mit der HETTICH-Zytozentrifugen- Technik präparierten Liquorzellen im Vergleich mit solchen präsentiert, die mit der Sedimentkammer-Technik erhalten wurden, z.B. bei entzündlichen und malignen Erkrankungen des ZNS, sowie bei Blutungen; es wird auf Unterschiede in der Zelldarstellung eingegangen.
Folgerung: Die HETTICH-Zytozentrifugen-Technik erscheint zur Standardisierung von Präanalytik und Analytik der Liquorzellen geeignet. Polykationen-beschichtete Objektträger bringe
64.TISSUE SECTION IMAGE ANALYSIS OF PROSTATE CARCINOMA:MATHEMATICAL HISTOGRAM RECALCULATION RENDERS CORRECT PLOIDY EQUIVALENTS
MAIRINGER Thomas MD, GSCHWENDTNER Andreas MD
Dpt. of Pathology, University of Innsbruck, Innsbruck Austria
Aim of the study: DNA Content has proven to be an important prognostic factor in prostatic carcinoma. Due to high intratumoral DNA-heterogeneity ploidy-measurements on thin histological sections within preserved histological structures would be desireable for localization of aneuploid clones. Mathemathical correction of DNA-histograms obtained by DNA- measurements on thin sections rendered accurate results when applied on rat liver tissue and non-malignant human tissues if the exact section thickness of the slide under investigation is known.The aim of the study is to evaluate the potential of theses mathematical correction methods when applied to prostatic carcinomas.
Materials and Methods: 20 prostatic carcinomas (7 aneuploid, 7 diploid and 6 tetraploid tumors) were investigated. Thin histological sections as well as single cell
65. COMPARISON OF DIFFERENT MATHEMATICAL ALGORITHMS TO CORRECT DNA HISTOGRAMS. OBTAINED BY MEASUREMENTS ON HISTOLOGICAL SLIDES
Mairinger T., Gschwendtner A.
Dpt. of Pathology, University of Innsbruck,lnnsbruck, AUSTRIA
Introduction: Several mathematical algorithms have been published so far to correct DNA-histograms obtained by DNA-measurements on thin sections with image cytometry. The aim of the study was to compare the results of these different mathematical approaches using rat liver tissue as a suitable cell model.
Material and Methods: A series of sections with different section thicknesses were cut from a rat liver of known ploidy. The actual section thickness was evaluated accurately. The actual section thickness was evaluated accurately. The DNA was measured on these sections with an image analyser. Knowing the actual section thickness different algorithms were applied to the slab fragments in order to recalculate for the genuine DNA-content of the whole nuclei. The obtained histograms were compared to the original histogram of the sections.
Results: The advantages and disadvantages of the different methods are shown and discussed according to different investigated section thicknesses.
Conclusion: Using mathematical algorithms for correcting DNA- histograms seem to be a promising approach to enhance the performance of DNA-measurements on histological slides. For practical purposes these methods have to be evaluated on different types of human tissue.
66.INTERFERON-ß (IFN-ß) VERMINDERT AKTIVIERTE T-LYMPHOZYTEN, ABER NICHT B-LYMPHOZYTEN UND FETAL-LYMPHOZYTEN IM PERIPHEREN BLUT BEI MULTIPLER SKLEROSE (MS)
E. Mix, J. Höppner, K. Stefan, H. Meyer-Rienecker, T. Klauer*, A. Rolfs;
Klinik für Neurologie und *Klinik für Psychosomatik und Psychotherapie, Universität Rostock.
In einer Phase-lII-Studie mit IFN-ß1b (BETAFERON (R), Schering) wurde der Aktivierungsmarker Interleukin-2-Rezeptor (CD25) mittels Fluß zytometrie (FACS) auf T-Zellen (CD3+), B-Zellen (CD19+), Fetaltyp-T-Zellen (y6+CD3+) und Fetaltyp-B-Zellen (CD5+CD19+) im peripheren Blut bestimmt. MS-Patienten mit schubförmigem Verlauf wurden zu 8 Zeitpunkten untersucht (Tag 1, 5, 15, 31, 60, 90, 180 und 270 nach Therapiebeginn): (1) Verumgruppe (N=8) mit 2-tägiger Gabe von 8 Mill. Units und (2) Placebogruppe (N=4) mit dreimonatiger Placebogabe und ab Tag 90 Therapie wie (1). Die wesentlichen Ergebnisse in der Verumgruppe sind: (1) Signifikanter Abfall der aktivierten T-Zellen in der Verumgruppe bis Tag 90, danach Rückkehr zu Ausgangswerten, (2) signifikanter Anstieg der aktivierten B-Zellen ab Tag 180, (3) signifikante Zunahme der Fetaltyp-B- Zellen nach Tag 31 und der aktivierten Fetaltyp-B-Zellen nach Tag 90, (4) relativ stabile intraindividuelle Fetaltyp-T-Zell-Spiegel mit generell geringer CD25-Expression, aber punktuellen CD25-Expressionsgipfeln. In der Placebogruppe wurden keine signifikanten Änderungen der gemessenen Zellparameter gefunden. Es wird geschlußfolgert, daß IFN-ß bei MS-Patienten (1 ) die systemische T-Zell-lmmunität reversibel supprimiert und (2) die Fetaltyp-Lymphozyten, besonders vom B-Zelltyp, langfristig stimuliert.
67. CHROMOSOME TERRITORIES ARE VARIABLE DURING THE CELL CYCLE
S.Monajembashi, H.Dittmar, C.Bock and K.O.Greulich
Institute for Molecular Biotechnology, BeutenbergstraBe 11, D-07745 Jena, Tel./Fax: **49-3641-656409/10
The spatial correlation and the form of selected chromosomes (2, 7, 9, X) in the interphase nucleus was investigated by Fluorescence in Situ Hybridization (FISH). Conventional epifluorescence microscopy and image processing were used to visualize the whole chromosome painting probes which were stained either with CY3 or CY5. Since lymphocytes are not synchronized, interphase nuclei in different cell cycle phases could be found on the cover slide.
Two types of image could be observed: a) in a few cases, chromosome domains are highly compact and clearly separated from each other and arranged in pairs of homologues. The chromosomes appeared on a circle in the exterior volume of nucleus. Probably these nuclei represent the situation close to mitosis. b) in most cases the domains are bigger and packed more loosely. They fill much larger regions of cell nucleus. These results indicate considerable dynamics of chromosome territories during the cell cycle.
68. BESTIMMUNG DER ANTIBIOTIKAEMPFINDLICHKEIT VON BAKTERIEN MITTELS DURCHFLUßZYTOMETRIE
Sabine Nuding1, Holger A. G Müller2
1Universität Stuttgart-Hohenheim, Institut für Mikrobiologie
2Institut für Laboratoriumsmedizin, Klinik am Eichert Göppingen
Die steigende Zahl an multiresistenten Keimen und die damit verbundene Problematik für die Therapie erkrankter Patienten erfordert Schnell methoden zur Bestimmung der Antibiotikaempfindlichkeit.
Die bisherigen Verfahren benötigen minimal Analysezeiten zwischen 24 und 48 Stunden.
Eine Möglichkeit zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Bakterien ist der Nachweis von Veränderungen des Membranpotentials. Membran schäden bzw. Zelltod verursachen einen Zusammenbruch des Membran potentials, der mit den fluoreszierenden Farbstoffen DiBAC4(3) und DiOC5(3) nachgewiesen werden kann. Der anionische Farbstoff DiBAC4(3) kann nur in depolarisierte Zellen eindringen und bindet an lipophile intrazelluläre Komponenten, dadurch fluoreszieren die Zellen. DiOC5(3) gehört zu den Cyanin-Farbstoffen und wird in lebenden Zellen akkumuliert, so daß diese fluoreszieren.
Bei einer Schädigung der Zellmembran kommt es zum Austritt des Farbstoffes und damit zu einer Abnahme der Fluoreszenz.
Die Zu- bzw. Abnahme kann im Durchflußcytometer gemessen werden. Bereits 90 Minuten nach der Einwirkung verschiedener Antibiotika sind bei E. coli und Staphylococcus aureus zuverlässige Aussagen über die Empfindlichkeit der Keime möglich. Im Dot Plot-Modus ist eine deutliche Unterscheidung zwischen lebenden und geschädigten bzw. abgetöteten Zellen möglich.
Die Testergebnisse stimmen mit den Ergebnissen des herkömmlichen Blättchen-Diffusionstests und mit der Analyse in einem Gerät (Baxter WalkAway 96) überein und zeigen eine enge Korrelation zur Anzahl der ermittelten CFU.
69. A DEVICE FOR INFLUENCING THE COORDINATED CONTRACTION OF ISLES OF EMBRYONIC CARDIAC MYOCYTES IN AN OPTICAL MANNER.
Götz Pilarczyk, Karl Otto Greulich
Institute for Molecular Biotechnology, Beutenbergstrasse 11, 07745 Jena, Germany, Phone: ++49-3641-656402
The cellular process leading to the excitation of a cardiac ventriculocyte involves a set of cytosolic as well as plasmalemmal and ER based parts. A central aspect is the transient rise of cytosolic calcium concentration. Here we introduce a microscope based system for influencing the cytosolic calcium level in a low invasive way but with high temporal and spatial resolution. The data are recorded by an intensified digital imaging system with a temporal resolution in the msrange to visualize the cytosolic phenomena with temporal and spatial resolution comparable to that of the stimulation system and the cell response as well.
The system combines two illumination sources in a way that a UV-filtered mercury arc lamp is focused to the center of the object while another light source (mercury arc lamp or argon ion laser) illuminates the object with blue-green light. Using the first source one is able to resolve or remove calcium ions via a UV-labile substance (a caged compound) while the cellular effect is observed via excitation of the calcium sensitive dye "Calcium Green-1". The spectral properties of the used substances are in such a manner that they can be selectively influenced with no effect on the other illumination/dye pair. Also attached are a device to microinject the caged calcium compounds and an electrophysiologic amplification system.
The above described setup can be used to visualize and influence the conductive properties in a population of chemically and electrically connected cells. It enables one to regulate the spatial pattern of signal transfer inside of such a group and will in future provide a system for the simulation of arrhythmia- and fibrillatory like situations in small areas of a heart muscle.
70.PROZEßMONITORING VON ANZUCHT- UND GÄRVERFAHREN IN VERSCHIEDENEN SÄCHSISCHEN BRAUEREIBETRIEBEN
Petzold, Louise und Müller, Susann
Universität Leipzig, Sächsisches Institut für Angewandte Biotechnologie (SIAB), Permoserstr. 15, 04318 Leipzig
Die großtechnische Herstellung von Bier erfordert ein Biomonitoring der Betriebshefe während Anzucht, Gärung und Lagerung. Dabei sollen vor allem die Prozesse im Propagator und im geschlossenen zylindrokonischen Gärtank transparent gemacht werden, wobei Zellzyklusanalysen und Funktionalitätstests mittels Durchflußzytometrie durchgeführt und mit konventionellen Daten (z.B. Gärkarten) verglichen werden.
Ziel der Untersuchung ist es, ein on-line Biomonitoring in einer Brauerei zur Vermeidung von ökonomischen Verlusten bei der Bierherstellung zu etablieren, Eingriffe in die Prozeßsteuerung zu ermöglichen und eine Prozeßoptimierung zu erreichen.
Es wurden Untersuchungen an industriellen Proben (Saccharomyces carlsbergensis) aus verschiedenen sächsischen Brauereien vorgenommen. Es ist üblich, Hefezellen in sogenannten Vorkultivierungsreaktoren anzuziehen, um eine für die Gärung ausreichend hohe Zellzahl zu erreichen. Positive Nebeneffekte dieser Vorkultivierung sind einerseits eine ständige Juvenalisierung der Kultur, wodurch deren physiologische Eigenschaften verbessert werden, und zum anderen die Verhinderung mikrobieller Kontaminationen durch sonst notwendige lange Lagerzeiten der Hefezellen in Lagertanks. Während der Proliferation verfügen die Zellen über einen hohen 3ß-Hydroxysterolgehalt sowie über einen geringen Neutrallipidgehalt (Sterylester und Triacylglyceride). Diese beiden Inhaltsstoffe und der Gehalt an chromosomaler DNS sind untersucht worden, um durch prozeßdynamische Prozeßsteuerungsstrategien Einfluß sowohl auf die Qualität (physiologischer Zustand) als auch auf die Quantitat (Zellzahl) der Hefen nehmen zu können.
71. DER FLOW-KARYOTYP DER INTERPHASEN-CHROMOSOMEN VON ARABIDOPSIS THALIANA
Tatiana 1. Samoylova, Armin Meister und Simon Misera
Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, D-06466 Gatersleben
Der DNA-Gehalt verschiedener aneuploider Linien von Arabidopsis thaliana wurde durchflußzytometrisch an DAPI-gefärbten Interphasekernen in Suspension bestimmt und mit dem Wildtyp verglichen. Die Abweichungen aller Linien vom Wildtyp waren sehr gut reproduzierbar und erlaubten die Abschätzung des relativen DNA-Gehaltes jedes Arabidopsis-Chromosoms bzw. einzelner Chromosomenarme.
Mit Ausnahme der Linie mit dem kleinsten Telotrisom (Tr 3A) ergaben sich für alle untersuchten Trisome signifikante Differenzen zum Wildtyp. Daraus läßt sich folgern, daß sich unter den vorliegenden experimentellen Bedingungen Differenzen nachweisen lassen, die 3 % des Arabidopsis-Genoms überschreiten.
Die Summe aller Differenzen der einzelnen Trisome zum Wildtyp stimmte gut mit dem erwarteten DNA-Gehalt für den haploiden Chromosomensatz überein.
72. MULTICOLOR FAST-FISH OF HUMAN METAPHASE SPREADS USING A CHROMOSOME SPECIFIC REPEAT DEPLETED DNA LIBRARY PROBE IN COMBINATION WITH CENTROMER PROBES
L. Schüssler(1,3), M. Durm (1), H. Münch (1), J. Craig (3), H. Ludwig (2), M. Hausmann (1), C. Cremer (1),
(1) Division of Applied Optics and Informationprocessing, Institute of Applied Physics, University of Heidelberg, D-69120 Heidelberg, (2) Institute of Pharmaceutic Technology and Biopharmacy, University of Heidelberg, D-69120 Heidelberg, (3) Institute of Anthropology and Human Genetics, University of Munich, D-80333 Munich, F. R. Germany
For chromosome painting, in sita suppression of repetitive DNA sequences has been well established. Such standard protocols usually require large amounts of Cot-1 DNA. Recently, it has become possible to deplete repetitive DNA-sequences from library probes by magnetic purification and PCR-assisted affinity chromatography. These "repeat depleated library probes" appear to be extremely useful for Fast-FISH, a technique omitting denaturing chemical agents such as formamide in the hybridization buffer, resulting in a substantial acceleration and simplification of the complete protocol. Here, for human lymphocyte metaphase spreads the application of multicolor Fast- FISH to repeat depleted, directly fluorochrome labelled library probe of the q-arm of chromosome 15 in combination with centromere probes for chromosome 1 and 5 is shown.
Following painting without Cot-1 DNA and without formamide, visual inspection revealed sufficient chromosome painting of 15 q after a few hours of hybridization. The fluorescence signals of these labelling sites were analyzed after hybridization times of 1 and 2 hours (in one case 4 hours) using digital fluorescence microscopy. The painting efficiency expressed in values of relative fluorescence signal ratios was quantitatively evaluated by image analysis using line-scan procedures and area-morphometry of mean luminescence. Two procedures (ethanoldehydration without and with RNAse A treatment followed by pepsin digestion for different exposure times) were compared. The results indicate a substantial accelaration and simplification of the FISH procedure since RNAse A treatment and pepsin digestion appeared to be protocol steps which can be omitted.
73. NEW ASPECTS ABOUT p53-EXPRESSION IN RELATION TO UVA1-INDUCED APOPTOSIS
*U.Schulz, H.Langhoff, H.Heise, V.Wolf, *H.-J. Thiesen
*Institute of Immunol. and Dept.Dermatol., University of Rostock
Exposure of mammalian cells to UVA in vitro results in fundamental metabolic and structural alterations, including initiation of signal transduction pathways, gene expression and apoptosis in a dose - and wavelength dependent manner. It is well established, that the tumor suppressor protein p53 at first induces a cell cycle block in the G1 - phase upon cellular DNA - damage, at second p53 is involved in nucleotide excision repair and at third in the apoptotic response to damaging agents.
The aim of the present study was to assess the possible importance and requirement of p53 for induction of apoptosis after UVA1 - radiation.
Lymphocytes from different human donors were preincubated in PBS, containing varying high concentrations of amifostine, magnesium and acetylcysteine. After 30 minutes Iymphocytes were irradiated with 10 J/cm2 of UVA-1 or 100 mJ/cm2 UVB and RPMI 1640 medium was added to the culture systems. After incubation of 0.5, 2, 4, 12, 24, 48 and 120 h the samples were analysed by XTT-assay, Trypan-blue exclusion and flow cytometry using autofluorescence, scatter characteristics, a v,zide panel of monoclonal antibodies (including AntiApo-1 and p 53 protein antibody) and Annexin V.
We were able to detect UVA1 - induced apoptosis of Iymphocytes by different methods. Especially, an immediate and a delayed phase of apoptosis were demonstrated, which both are reducible by the radical scavengers amifostine and acetylcysteine or magnesium. In contrast to UVB-irradiated cells p53 protein could not be detected in UVA, irradiated cells by intracellulär FACS analysis.
We conclude that the induction of apoptosis by UVA1 - radiation is first of all independently mediated in relation to p53 and partially inhibited by thiols and magnesium in therapeutical relevant concentrations.
74. GALECTIN -1 MEDIATED IMMUNOSUPPRESSION IS ASSOCIATED WITH THE INDUCTION OF APOPTOSIS
U. Schulz 1, p Neels 2, J. Brock 2, H. Walzel 2
Institute of Immunology 1 Institute of Medical Biochemistry 2, University of Rostock, Germany
Placental galectin -1, a member of the galectin family of soluble 13-galactoside binding proteins, inhibits the alloantigen - and mitogen - induced proliferation of human peripheral blood Iymphocytes. Galectin -1 mediated proliferation inhibition of the human leukemic T-cell line Jurkat was found to be associated with an increase in intracellular calcium concentration ( [Ca 2+ ] i ) and the induction of apoptosis.
Flow cytometric measurements revealed that the lectin induces a time - and concentration - dependent increase in phosphatidylserine expression as detected by annexin - V FITC / PJ staining. These effects on phosphatidylserine expression were found to be markedly reduced in the presence of lactose. DNA-fragmentation appeared in agarose gels as a ladder pattern after incubation of Jurkat T cells with galectin -1 for 6 h. These results indicate that galectin -1 modulates the immune response by induction of apoptosis in activated T cells.
75. APOPTOTIC LUTEIN CELLS: FLUORESCENCE IMAGING AND FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS OF THE DNA FRAGMENTATION, DETECTED BY THE TdT ASSAY, AND OF THE TRANSMEMBRANE POTENTIAL DIFFERENCE, DESCRIBED BY A OXONOL DYE.
Torsten Viergutz, Bertold Löhrke, Ralf Pohland, Frank Becker
Research Institute of Animal Biology, Dummerstorf-Rostock
Introduction.
Luteolysis is characterized by a loss of luteal cells. Apoptosis and necrosis may play a role, but the relevance of these and other cell death forms is poorly understood.
Methods.
Lutein cells were phenotyped by size, granularity and LH binding sites. The integrity of their plasma membrane was assyed by supravital measurement of the plasma membrane potential difference described by the oxonol dye DiBaC4(3), which is repelled from negativ charged membranes, as well as by propidium iodide uptake. DNA breaks were detected by the TdT assay. The DNA fluorescence was the basis of flow cytometric analysis and DNA imaging. Lutein cells from luteal early, mid-, and late phase were studied without and with treatments in vivo and in vitro for apoptotic stimulation or inhibition .
Results.
Apoptotic morphology was clear cut by fluorescence imaging. Quantified fluorescence imaging and flow cytometric analysis of the fluoresceinated DNA were highly correlated. However, flow cytometry was more sensitive in detection of DNA strand breaks. The fluorescence intensity of the fluoresceinated DNA had a maximum ( day 12 midphase cells ) which preceded the maximum of the percentage of cells with fluoresceinated DNA ( day 16 late phase cells ). Day 16 luteal cells were depolarized wereas early and midphase cells were hyperpolarized. Uptake of propidium iodide was increased in day 16 luteal cells. However, propidium iodide uptake, believed to be increased in apoptotic and necrotic cells, was not different in early luteal phase cells and hyperpolarized midphase cells which exhibited maximal DNA fluorescence intensity per cell.
Conclusions. Apoptotis morphology and functional aspects are detectable by fluorescence imaging and flow cytometry when both based on TdT-mediated DNA fluoresceination. The detection of plasma membrane potential difference described by DiBaC4(3) provides a reliable indicator for intact plasma membrane which is completely maintained in luteal cells with a maximum apoptotic DNA fragmentation intensity.



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